下游生物工艺展望：通过技术创新，将产品知识运用到工作中

本文节选自专访《The Downstream Perspective: Putting Product Knowledge to Work Using Technological Innovations》。原文探讨了下游生物工艺表征、质量确认和验证等多个方面的内容，详细内容，请参考原文。

一次性使用系统

一次性使用技术，如膜吸附，如何有助于加速达到IND（speed-to-IND）战略？

在研究型实验室中，一次性使用材料在早期开发中的应用已经有相当长的时间了。膜吸附和一次性使用层析柱则是最近的发展。当需要的产品量很低，而目标回收率和确认时间对公司来说至关重要时，转向一次性使用的系统是合乎逻辑的。因为研究实验室已经习惯了一次性使用物料，如吸液管和管路，其使用经验有助于对一次性使用过滤器、膜吸附和层析柱的接受。一些新技术，如用于产物浓缩和洗滤的过滤器也有助于简化下游操作。

一次性使用的特点有助于加速产品回收，以进行初始目标设计和确认、动物试验以及体外研究，这些特点包括简单易用(大多数是即取即用的物料)、消除搬运问题，且可控制微生物污染。一次性使用材料及其包装通常针对ISO标准实验室设计。

不过需要注意的是，在产品开发的早期阶段，很少关注可放大性。然而，一旦到达毒理研究物料的制备，这一点就开始变得非常重要，更别说更往后的开发道路。

自动化

通过自动化克隆筛选和微型生物反应器，我们看到上游时间线可被显著缩短。这些技术如何改变DSP的游戏的呢？

在DSP中，基于自动化的技术取得了相当大的进展。用于多步处理的系统就是这样一个进步例子。例如，它们可以将收获的培养液上样到第一根层析柱上，而在多步DSP的出口回收几乎完全纯化的物料。只要收获的培养液的成分变化不大，目标产品的纯化应该就可以采用平台化的工艺。当然，多步处理设备还需要更多的功能，如自动化控制和触发器，以收集和准备产物，用于DSP中的下一个步骤，包括：产物料液调节(如，pH调整和稀释)，在线过滤，以及让中间体在特定条件下停留一定时间。

多步DSP示例;(A­)三根层析柱工艺，整合反应和工艺液流调节;(B)四根膜吸附柱，整合反应和工艺液流调节;(C)使用两根层析柱和一根膜吸附柱的三步工艺，整合反应和工艺液流调节。

自动化对实现连续层析来说，是至关重要吗？

当然，连续层析必须使用自动化设备。如果多根层析柱没有“编配”好阀门和仪器，连续的操作是不可能实现的。对于上述多步DSP系统也是如此。可实现自动化培养基和缓冲溶液筛选的系统现在不仅用于柱层析，也被用于基于膜的工艺。事实上，该领域的另一个进步是可以平行测试多根层析柱、膜或过滤单元。筛选条件的选择基于对产品、杂质和物料的了解。

高通量筛选（HTS）

同样，我们也看到了用于上游培养基配方筛选的高通量方法。高通量筛选可以为下游工艺开发 – 如层析介质筛选 – 做些什么呢？

高通量筛选系统也适用于DSP，如用于层析介质、膜和过滤器筛选的不同形式系统。此类形式包括96孔滤板、移液管吸头和微型层析柱。过滤板和移液管吸头通常只需要50-100μL的介质以及相似量的样品体积，这允许降低每个测试条件所需的样品体积。膜吸附也是如此：例如，用于分离的每个孔的膜表面积为3 ×0.7 cm2。

在96孔滤板中，含有目的蛋白的样品与填料混合或抽吸，以进行结合，并通过不同的pH值或盐浓度，进行洗脱。流穿的物料和洗脱液可使用真空或离心过程收集，同时将填料留在滤板中。对于移液管吸头，不同的上样和缓冲液通过装置，并在吸头出口收集馏分。用于机器人高通量筛选的层析柱的内径为5mm，高度可达30mm，柱体积通常在100-600μL范围内。

在Tecan的Fluent实验室自动化工作站上操作的Repligen的OPUS RoboColumn微型层析柱。

为了选择正确的形式和装置，重要的是先要确定筛选、开发或表征研究的目的。目的可能是获得对吸附和解吸附条件、工艺范围和质量属性或步骤收率之间相关性的初步了解。在使用Protein A层析单克隆抗体(MAb)捕获工艺进行的不同高通量平台的比较中，开发人员得出结论，上述各种形式都有可能在不同的程度上帮助获得对产物质量和单体纯度的高水平的科学理解。

将机器人液体处理平台(如Tecan和PerkinElmer的系统)与更多的支持工具相结合，使上述筛选设备的使用成为可能，从而产生了令人惊叹的研究吞吐量。需要注意的是，特定的层析或膜工艺方法需要编入机器人液体处理系统。保持液流、缓冲液和样品或馏分分开至关重要，以防止交叉污染。可移动96孔板的移动式机器人可以进一步提高通量。

工艺分析工具（PAT）

现场/工艺中(近线/在线)测试对加速DSP是可行的吗？它在时间线上可以帮助获得什么不同呢？这些技术还有改进的空间吗?

用于参数，如pH、电导率、温度和压力，的标准工艺控制设备是筛选系统的重要元素。然而，工艺相关杂质，如宿主细胞蛋白(HCP)、DNA以及产品相关物质的浓度还不能自动测量。高通量平台涉及大量极低体积的样本，因此大多数质量属性需要使用对样品量要求较低、且可实现平行分析的离线方法进行。

一些公司也会使用高通量平台进行样品分析。在线UV -2波长或光电二极管阵列(PDA)探测器，可以根据不同的吸收模式，提供有关产物和杂质浓度的信息。其它光谱方法，如拉曼光谱法，似乎有潜力应用于指示DSP开发中的产物和杂质浓度。在上游工艺中，使用这种在线方法已经取得了一些进展，一些公司和大学正在研究将这种技术转移到DSP。

平台和先验知识 

即使新的方法和方案正在改变一些事情，先验知识的评估仍然很重要。什么样的下游平台方法有助于加快速度？

收集有关目标分子及其物理化学和结构性质的先验知识，以及有关杂质基质的信息是DSP开发的起点。对于每个公司或在开发的每个阶段，“平台”这个术语可能有不同的定义。但是建立过滤工艺平台，以降低生物负荷和潜在的病毒清除，以及通过热处理过程来灭活病毒，可以为DSP中不同的产品和细胞培养源性料液提供通用的方法。

对于具有相似特征的目标分子(例如“标准”的单克隆抗体)，平台方法可以扩展到通常由Protein A亲和层析完成的捕获步骤。对捕获洗脱液中，固定相、单抗和杂质分布的了解，是影响中间体纯化和精制步骤条件选择的关键因素。对于新分子，我们经常可以通过不同方式利用我们对工艺相关杂质的知识，如HCP、DNA和培养基成分。

跨职能团队

让上游专家参与下游决策是否有帮助，或者反过来呢？还有哪些功能可以提高DSP的开发效率？

跨职能团队可为开发项目带来了多方面的好处，特别是在防止“糟糕”的意外情况，如上游条件的变化，这会导致DSP结果出现偏差。组建这样的团队需要专门的培训或专业知识，以及专注于项目目标的开放心态。拥有不同知识和观点的团队成员之间的讨论和交流，也会花费更多的时间。分析专家是有助于DSP的关键团队成员：如果不理解分析方法的能力，我们对DSP研究的解释可能会不准确。团队中也需要有制剂方面的专家。最后，同样重要的是，临床和法规团队成员对开发工作的指导也至关重要。

质量源于设计（QbD）

许多公司在产品开发中会推迟QbD的实施 - 例如在临床试验期间，由于必须遵守良好生产规范(GMP)时，才会考虑。但是，在早期开发中包含风险评估，并确定质量属性会有帮助吗 - 或者，这会不可避免地降低开发速度吗？

在新产品、二代产品和生物仿制药的早期开发中，诸如知识和风险管理等的QbD的原理正被越来越多地、以结构化的形式采用。此外，对除病毒研究进行规模缩小模型论证和风险分析是必须的，特别是对于从哺乳动物细胞培养中提取的产品，而且必须在产品可用于临床试验之前，满足安全要求。根据许多公司的指导方针，从非GMP环境到GMP环境的技术转让，必须有风险评估的支持。DSP单元操作规模缩小模型可以加快后续的开发阶段。QbD要求有目标的、结构化且科学合理的方法来进行早期开发，但并不一定会给DSP开发项目增加额外的工作。

外包

与合同开发和生产组织(CDMO)合作的哪些方面会降低下游工艺开发的速度？厂商如何缓解这些问题？

总的来说，使用CDMO可以加速项目开发；当然，在某些情况下，这也可能会减慢速度，如额外的信息交换接口和风险、文化和语言差异、装运延迟等。请注意，在项目的某个阶段放慢速度 - 例如，因为需要更多的信息或进行不同的研究 - 对项目的长期发展是有益的。实现预定的“智能”目标的关键因素包括针对DSP开发的CDMO的经验、知识和资产；双方在开放交流的氛围中，与来自不同公司的跨职能团队合作的能力；以及扎实的项目管理原则的应用。

表征

分析和早期的产品表征工作(例如，HCP特性和产品异构体分析)是如何帮助DSP开发的呢？

产品表征是DSP早期开发的关键。一种药物底物的初始稳定性研究可以帮助我们了解工艺条件，例如，增加其聚集，脱胺或氧化。在早期DSP中，分析方法可能显示出更高的变异性。了解产品、分析方法和生产工艺中的变异性，对于确定药物是否可以用于临床前研究以及确定其是否可以转入GMP生产，至关重要。确定未来的DSP开发计划和里程碑也需要表征数据。

警告

当质量和安全受到威胁时，只关注速度可能是错误的。当需要缩短下游工艺开发时间线时，您将如何提醒其他人？

如果没有达到安全标准或分析能力，就没有办法缩短DSP的开发时间，或使用这些工艺所获得的物料进行毒理学研究或人体治疗。有时，要确定临床前研究中应该使用的确切产品质量特性，可能更加困难。医学专家必须参与到这种评估中来。但即使对他们来说，在早期开发中，将某些产品形式与产品功效联系起来，可能也很困难。这里，风险评估可以帮助确定目标产品质量标准，并确定是否可以使用产生的物料。

目前，已经开发了许多工具和方法，用于帮助加速DSP开发，以到达IND申请阶段，特别是MAb产品。将这种技术转化至其它类型的生物药产品也是必要的。

原文：M.Holzer, The Downstream Perspective: Putting Product Knowledge to Work Using Technological Innovations. BioProcess International, 2020.

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