微升级高通量工艺开发工具，可获得与生产工艺相当的性能及产物质量
来自美国MedImmune公司的研究人员在《Journal of Chromatography A》杂志上发表了题为“Optimization of a micro-scale, high throughput process development tool and the demonstration of comparable process performance and product quality with biopharmaceutical manufacturing processes”的文章。文中，研究人员介绍了一种高通量工艺开发（HTPD）工具，其使用商品化的微升规模层析柱技术，进行多种临床相关单克隆抗体的纯化。使用这种优化的工具所获得的色谱图显示可与传统实验室或临床生产规模系统获得的色谱图良好重叠。此外，所有规模条件下，纯化的mAb的所有质量属性相当。除了可支持纯化工艺开发（如优化筛选）外，所有规模条件下，相当的产物质量属性结果使这种工具成为实现HTPD生物反应器条件纯化及产物质量比较的合适规模模型。平行层析纯化的能力降低了单次运行所需的物料，从而可在更短的时间内，获得更多的工艺了解。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
简介
高通量工艺开发（HTPD）应用快速发展的平行处理和自动化技术，加速生物工艺的开发。相比传统规模缩小模型，HTPD工具可帮助科学家提高可进行的实验数量，并显著降低单次实验所需物料。现代化的HTPD工具加入了自动化功能，可提高液体操作的精确性，并实现自动化的实验操作。更高的通量、更低的物料需求以及实验员动手时间等优势的结合，有助于实现更加稳健的生产工艺的开发，帮助科学家获得对工艺更加透彻的了解，并潜在地缩短开发时间线。近几年，纯化HTPD工具的使用越来越多，包括用于批量结合实验的过滤器板、用于纯化的微量移液层析吸头以及微型层析柱。
过滤器板批量实验可进行平行筛选，用于确定结合载量、结合动力学以及杂质清除，但是这种方式不能直接地用于定量预测装填柱床层析柱的性能，比如压缩系数、塔板数以及不对称性等。出于这个原因，目前一般会将过滤器板筛选与微型层析柱结合使用。微量移液层析吸头可用于自动化工作站，获得与实验室规模系统一致的载量、产量和纯度趋势分析，但是微量移液吸头获得的参数值还没有被广泛证实或接受直接用于生产层析工艺的开发。
生物制药行业已经对微型层析柱（如Repligen的MiniChrom®和RoboColumn®）已经进行了广泛的研究，以确定其对于生产规模层析工艺的开发和优化，是否是更为合适的HTPD工具。圆柱形的装填柱床层析柱可更好地模拟更大规模条件下的参数，包括单向液流、等价的保留时间以及蛋白质上样载量，这些对于不同规模的并行比较来说都是不小的挑战。已有多个使用不同层析介质类型对已良好表征的蛋白质进行的实验，证实了这种方法可获得相当的产物质量和层析行为，最近有报道证实了自动化微型层析柱在预测使用实验室规模系统可获得洗脱图形中的适用性。
大量的学术研究证实，RoboColumn®对于已良好表征的生物制品具有强大的预测能力和高通量处理能力。而生物制药行业将该技术整合到生产工艺开发中来，期待更多关于使用HTPD工艺进行临床相关分子纯化工艺开发的文献报导，以及证明HTPD方法在预测生产规模性能的数据。
本研究提出了一种基于Excel的工具，用于进行RoboColumn®实验设计，简化实验设置以及运行后的数据分析。整合的HTPD工艺可基于馏分数或柱体积生成色谱图。生成的色谱图用简单用于与更大规模条件下获得的色谱图进行比较，或用于定性预测更大规模条件下的工艺性能。HTPD工艺也可通过对馏分数（或柱体积）与收集板之间的简单校准，实现产量计算和分馏。研究评估了不同层析规模之间的产物质量，证实了使用这种微升规模模型来开发生产规模层析条件的可行性。
材料和方法
实验使用三种不同抗体，以涵盖不同的pI范围：mAb1为IgG4，pI接近6.0，mAb2和mAb3为IgG1，pI接近9.0或更高。IgG分子量均接近150kD。不同规模实验使用Tecan EVO系统、转子泵系统、AKTA™ Explorer 100或生产规模层析工作站。评估的层析填料包括亲和、离子交换以及混合模式填料。mAb1的Protein A亲和捕获通过不同的洗脱pH和上样pH进行研究。mAb2采用混合模式MEP层析柱。对于mAb3评估了一系列层析柱的组合，包括ProteinA亲和捕获以及之后的羟基磷灰石以及Super Q阴离子交换。对收集的馏分，使用行业标准方法，分析蛋白质浓度、单体、聚体以及片段化。
RoboColumn®-Tecan系统
使用基于Excel的工具进行RoboColumn®实验设计，该工具设计用于将实验室规模的纯化工艺转化到RoboColumn®规模。传统的规模缩小模型通过随层析柱直径（以及相应的柱体积）的增加而维持恒定的柱床高度和线性流速，保持与生产规模恒定的保留时间。RoboColumn®系统使用更低的层析柱柱高。通过随柱高降低，正比例降低线性流速，而达到恒定的保留时间。该工具用于根据实验室规模工艺描述，计算RoboColumn®规模所需的体积流速，并利用TeChrom Wizard编写EVOware 脚本。工具也用于计算每个实验需要的溶液体积（上样、缓冲液以及其它溶液），以方便计划安排。在Tecan设备上进行的RoboColumn®实验通常由4个自动化程序组成，包括1）设置和层析操作，2）将收集的少量馏分从96孔板转移至384孔板，以生成色谱图（板扫描），3）以UV读板器方式分析384孔板以及4）将选择的馏分收集到单个合并池中。以下每个步骤的详细介绍。
设置和层析操作：8根RoboClumn®微型层析柱安装在TeChrom台上，系统容器内装入适当的运行缓冲液。在程序运行过程中，8根RoboColumn®的每根约产生200μL洗脱馏分，收集在96孔板的排孔中。典型的Protein A层析RoboColumn®-Tecan运行以使用PBS溶液平衡层析柱开始，保留时间约为3.7 min，相应的线性流速约为50 cm/hr或体积流速2.7 μL/s。纯化过程中，流速保持恒定。5 CV（柱体积）的PBS之后，RoboColumn®蛋白质上样，上样量约为30 g/L固定相。层析柱上样后，以pH 5.5的50 mM 醋酸钠漂洗5 CV，然后以pH 3.6的50 mM醋酸钠缓冲液进行层析柱洗脱。洗脱阶段通常持续10-15 CV，以确保在没有在线UV检测器的情况下，大部分产物被洗脱。洗脱之后，层析柱清洗、消毒并储存。对于ProteinA层析，清洗和消毒通常使用2-3 CV的0.1-0.5 M NaOH。储存溶液一般为20%乙醇溶液或含有2%苯甲醇的溶液。
板扫描：通过对采集的20μL馏分进行UV-吸光度分析，生成色谱图。将来自4块96孔板的20μL体积转移至1块384孔板，并按需要进行离心。离心用于去除可能的气泡，气泡会影响浓度检测的准确性，并形成色谱图噪声。
板读数和数据分析：384孔板使用UV读板器读数，其检测280和340nm下的UV吸光度。读板器数据输出值上传到Excel文件。数据使用Excel编程宏处理，生成UV色谱图。每根RoboColumn®层析柱生成1张色谱图。色谱图包括以点表示的每个层析柱馏分的UV吸光度数据，并绘图连成直线。对于某些数据分析，通过色谱图重叠，比较不同纯化系统生成的色谱图。为对来自不同系统的层析数据进行更好的可视化比较，吸光度数据进行标准化处理。
馏分合并和中和：来自96孔板的馏分使用pH计离线检测pH。然后，使用生成的色谱图作为确定mAb产物洗脱池的指南，选择馏分并合并。检测产物洗脱池的pH。出于稳定性需求，可使用合适的中和缓冲液，中和至目标pH≥5.0。
其它规模实验，如实验室规模转子泵系统、AKTA™系统以及生产规模实验，和实验分析，请参考原文。
结果和总结
不同纯化规模条件下，mAb2混合模式精制层析代表性色谱图的比较，可见RoboColumn®色谱图与AKTA™规模色谱图以及生产规模色谱图良好重叠（S.T.Evans, et al., 2017）。
不同纯化规模条件下（RoboColumn® 600μL、转子泵1.0mL、AKTA™ 20mL、中试6.9及13.4L、生产规模31.8及100L），mAb1 Protein A亲和捕获的数据比较：A）HPSEC检测的单体含量（%），可见产物质量基本一致，单体纯度>95%；B）NRGE检测的片段化（%），可见所有规模下，片段化<10%（S.T.Evans, et al., 2017）。
3种不同纯化规模条件下，3步柱层析步骤（Protein A、Super Q以及HA）中，mAb 3的产物质量数据比较，可见数据基本一致（S.T.Evans, et al., 2017）。
更多详细的实验结果和分析，请参考原文。
使用RoboColumn®系统作为工艺开发工具的优势包括更高的通量、更多的时间节省、更低的物料需求以及其它的功能。此外，一些细胞培养微型化和自动化开发工具（如ambr®生物反应器）生产的产物量有限，此时，相比AKTA™规模缩小模型，RoboColumn®系统对上样物料更小的消耗将是一个明显的优势，其上样和缓冲液消耗，相比AKTA™规模缩小模型，可降低约33倍。RoboColumn®系统的平行高通量处理能力可使工艺开发人员在更短的时间内，使用更少的物料，进行更多的实验，而评估更多的条件。此外，尽管RoboColumn®洗脱的蛋白量（体积和质量）更少，产物质量分析仍可以进行，特别是使用低体积分析方法时。
使用RoboColumn®和AKTA™系统进行规模缩小纯化工艺的比较（S.T.Evans, et al., 2017）。
本文介绍了一种高通量工艺开发工具的优化和实施。实验将商品化的微升规模层析柱用于多种临床相关单克隆抗体的纯化。开发工具可实现色谱图的快速生成，相比之前使用的方法，具有诸多优势。在384孔UV透明板内分析蛋白质浓度，相比使用96孔板，可使UV透明板的用量降低4倍。使用这种优化的工具生成的色谱图可与传统实验室规模以及临床生产规模生成的色谱图良好重叠。在用于mAb纯化的不同规模条件下，所有检测的产物质量属性相当。RoboColumn®进行平行层析纯化的能力降低了每次运行的物料需求，且可在更短的时间内获得更多的工艺了解，以进行进一步的层析工艺开发（如在小规模生物反应器实验中进行优化筛选或产物质量表征）。
本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。
原文：S.T.Evans, K.D.Stewart, C.Afdahl, et al., Optimization of a micro-scale, high throughput process development tool and the demonstration of comparable process performance and product quality with biopharmaceutical manufacturing processes. Journal of Chromatography A, 2017, 1506: 73-81.
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