用于蛋白质UFDF的多参数PAT – 监测浓度、颗粒粒径以及缓冲液置换

Original XS Repligen瑞普利金 2022-12-21

来自德国卡尔斯鲁厄理工学院和Sanofi-Aventis的研究人员在2020年2月的《Analytical and Bioanalytical Chemistry》杂志上发表了题为“Multi-attribute PAT for UF/DF of Proteins—Monitoring Concentration, particle sizes, and Buffer Exchange”的文章。文中，研究人员指出超滤/洗滤（UFDF）在生物药生产中扮演着重要的角色。在这些步骤中，对关键工艺参数和质量属性的检测可促进工艺开发，并确保生产过程中一致的质量。所以，研究人员构建了配置可变光程（VP）紫外（UV）和可见光（UV/Vis）光谱仪、光散射光度计以及液体密度传感器（microLDS）的实验室规模切向流过滤（TFF）设备，以基于检测的信号，监测蛋白质浓度、缓冲液置换、表观分子量以及水动力半径。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。

简介

过程分析技术（PAT）在化工行业一直都是一个非常活跃的研究领域，但在生物制药下游工艺（DSP）中，PAT工具的开发和使用直到最近才得到了较多的关注。目前，DSP中的大部分研究关注于层析步骤的监测和控制，只有较少的研究评估用于切向流过滤（TFF）的PAT，尽管TFF在生产过程中至少需要使用一次。TFF在DSP中的使用出于多个目的：层析前，TFF可能用于降低工艺体积，并通过转向更有利的吸附等温线范围而提高工艺性能。在大部分DSP工艺流程末端，也需要一步UFDF步骤，以调节最终的制剂和蛋白质浓度。所以，TFF是大部分生物药生产工艺的基本组成部分。

在开发过程中，纯化的物料通常非常昂贵，特别是对于最终的UFDF步骤，且可用量非常少。质量属性和工艺参数的在线检测可通过减少取样和离线分析，而避免物料消耗。此外，可降低人为的干扰，这是造成误差的常见来源。PAT也可帮助提高对工艺的理解，因为相比标准的离线分析方法，其通常可达到更高的检测频率。在生产中，UFDF步骤通常用于将产物调节至比目标更高的浓度，并通过离线分析结果，在后续的步骤中，调节至最终的浓度。此外，该步骤中可能会引入后续步骤不能消除的污染物，如聚体或不可见颗粒。基于PAT的工艺控制可抵消偏差或用于使制剂工艺更加流畅精简。

此前，有报导使用简单的pH探针对洗滤（DF）步骤进行监测。在研究的应用中，pH值与污染物的消除相关，所以可为有效的工艺监测提供一种直接的方法。但这种方法有多个缺点。如作者自己指出的，pH探针容易发生错误，此外，pH值与污染物浓度的相关性只针对给定的工艺，且通常不适用于Gibbs-Donnan效应。最近，有文章报导了将可变光程（VP）紫外和可见光（UV/Vis）光谱法用于single-pass UFDF的研究，不过发表的数据侧重于对工艺的机制性理解，而不在于提供一个PAT方案。

在本研究中，研究人员开发了一种用于监测较宽范围不同UFDF工艺的灵活设置。设置包括实验室规模TFF设备，配置在线可变光程光谱仪以及带光散射光度计和微型液体密度传感器（microLDS）的随线检测回路。VP UV/Vis光谱仪可提供较大动态范围内的蛋白质浓度信息以及蛋白质三级结构变化的信息。粘度/密度检测可允许追踪DF进程和缓冲液置换。此外，基于散射光密度和蛋白质浓度，可计算表观分子量。动态光散射（DLS）检测结合工艺流体粘度，可用于监测产物的流体动力半径。实验设计将该设置用于三种案例研究，以评估其在不同工艺中的性能。

信息流显示不同信号的处理方式。深蓝色长方形所示为不同的传感器，淡蓝色平行四边形所示为检测信号。紫色圆角矩形所示为衍生的信号（L.Rolinger, et al., 2020)。

实验设置的管路和设备示意图。右下角为在线检测回路。所有传感器连接至用于中央数据采集的计算机。虚线所示为电子通讯线。字母表达为C：控制；D：密度；I：指示；P：压力；R：记录；U：多变量；V：粘度；W：重量（L.Rolinger, et al., 2020)。

UFDF实验

实验设置：UFDF实验使用KrosFlo® KR2i TFF系统，配置FlowVPE™ VP UV/Vis光度计并在TFF单元的回流容器之后设置T型接头，用于浓度确定以及取样用于离线检测。回流容器使用磁力搅拌器，以确保均匀混匀。回流容器上配置两根PEEK毛细管，为随线检测回路提供工艺内液体。在液流方向上，随线检测回路包括由数据采集设备控制的蠕动泵、0.5μm颗粒截留玻璃纤维针头过滤器、流通式microLDS、Zetasizer Nano ZSP光度计以及限流器。添加颗粒截留过滤器时为了防止堵塞microLDS并优化Zetasizer的信噪比。

SoloVPE™和FlowVPE™设备。

溶菌酶实验：UFDF实验使用3kD中空纤维过滤器，pH 5的50mM 醋酸用于稳定蛋白质并作为DF缓冲液。所有缓冲液经0.2μm过滤。10g/L 的150mL溶菌酶原液先以0.2μm针头式过滤器过滤。实验前，系统以45mL/min的流速运行5.5min，背压阀打开，以平衡所有腔室。然后TMP设置为1.5bar。UFDF包括UF浓缩至约20g/L，然后进行3DV的DF，之后再浓缩至40g/L。使用该浓缩-洗滤-浓缩程序主要是为了降低洗滤缓冲液消耗。

葡萄糖氧化酶（GOx）实验：UFDF使用3kD中空纤维过滤器，GOx溶解于pH 6.5的10mM磷酸盐缓冲液中，其作为UF缓冲液，浓度为10g/L。6M尿素溶解于UF缓冲液中，形成DF缓冲液。TMP设置为1.5bar，进样流速设置为45mL/min。30mL GOx原液加入回流容器，DF开始前，系统运行11min，以平衡所有腔室。进行4DV的DF操作，以换液至尿素缓冲液，之后再以平衡缓冲液进行4DV的DF。选择该工艺是为了研究仪器设置检测缓冲液诱导的结构变化的能力。

单克隆抗体（mAb）实验：mAb原液（2.79g/L）使用前用0.2μm过滤器过滤。实验使用30kD膜包及相应夹具，打开背压阀，系统以45mL/min的流速运行5.5min，以平衡所有腔室。工艺开始时，TMP增加至1.5bar。在第一个UF步骤中，浓度提高至17g/L，然后进行8DV的DF步骤，缓冲液置换成制剂缓冲液。第二个UF步骤将产品浓缩至120g/L。工艺基于常见的mAb生产工艺。

详细的数据采集及分析，请参考原文。

结果和总结

实验使用三种案例研究中对设计的PAT设置进行了测试。首先，在UFDF运行中使用溶菌酶，以显示在线和离线检测的可比性，获得的相关系数超过0.97。然后，在两步DF步骤中监测了尿素诱导的葡萄糖氧化镁（GOx）的蛋白质粒径变化。静态光散射（SLS）和动态光散射（DLS）的相关系数≥0.92。最后一个案例研究使用单克隆抗体（mAb），以显示该设置的全部潜力。同样，离线和在线检测具有良好的一致性，相关系数超过0.92。能够在线监测的蛋白质浓度范围较大，为3 – 120 g/L。在DF过程中，观察到与缓冲液相关的表观分子量的增加，这为工艺开发和稳定性评估提供了有趣的补充信息。

总结来说，在本研究中，开发了一种用于监测UFDF工艺的多功能设置，可用于三种不同的蛋白质和工艺。设置可用于检测蛋白质浓度、密度、粘度、z-均粒径以及表观分子量。在线蛋白质浓度、z-均粒径以及散射光密度与离线检测比较，达到了较高的相关系数。可认为，开发的设置可提供关于蛋白质浓度、聚集、颗粒形成以及缓冲液置换进程的有用信息。检测这些参数的能力使本设置成为一种极具潜力的研究和开发工具，用于测试不同的缓冲液系统。此外，可能可增加额外的传感器，如pH、电导或拉曼光谱，用于DF终点预测，因为仅用密度检测可能不能保证对所有缓冲液成分的选择性。设置也可用于监测生产过程，及时发现异常，避免偏差。开发的设置为评估不同UFDF工艺，提供了一种有力的测试系统，可能可作为开发工艺控制策略的起点。

本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。

原文：L.Rolinger, M.Rudt, J.Diehm, et al., Multi-attribute PAT for UF/DF of Proteins—Monitoring Concentration, particle sizes, and Buffer Exchange. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2020, https://doi.org/10.1007/s00216-019-02318-8.

SoloVPE™/FlowVPE™：C Technologies | 实时滴度监测 | mAb | 斜率光谱法

Repligen收购C Technologies, Inc

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