应用连续灌流原理，提高双特异性分子产物质量和产量
来自美国Amgen公司的研究人员在2020年1月份的《Biotechnology Progress》杂志上发表了题为“Improving Product Quality and Productivity of Bispecific MoleculesThrough the Application of Continuous Perfusion Principles”的文章。文中，研究人员指出双特异性蛋白结构相比传统单克隆抗体（mAb）更为复杂，因其需要两个不同的表位结合位点/结构域。鉴于分子复杂性的增加，双特异性分子较难表达，且相比mAb，更容易发生物理和化学降解，导致细胞培养中更高水平的蛋白质聚体，裁剪物质或修饰的残基。基于此，研究人员评估了其公司内部开发的三种类型双特异性分子生产的细胞培养性能。详细地说，研究总共培养了6种CHO细胞系，同时采用约12天的补料分批工艺和约40天的高密度灌流工艺。对从每种工艺收获的细胞培养液（HCCF）进行纯化，并分析其质量属性，包括聚体水平、裁剪物、电荷异构体、单个氨基酸修饰以及宿主细胞蛋白质（HCP）含量。结果总结来说，强化灌流工艺呈现出更好的产率和产物质量，突显了其作为双特异性结构连续生产工艺组成部分的潜力。
本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
简介
双特异性分子由于需要结合至一个以上的目的抗原，所以其分子结构更为复杂。双特异性结构通常包括单链可变片段（scFv）、连接体和工程化残基，以介导非对称性多肽链的正确配对。这些修饰的结构可导致细胞培养中形成新的产物相关杂质，包括高聚体水平、片段化或低分子量（LMW）物质，或潜在暴露的残基。例如，scFv结构域通常有较低的热力学稳定性，因此更容易聚集。细胞培养中其它水平升高的杂质包括双特异性融合蛋白中使用的连接体的裁剪，以及不对称分子与高水平的半-mAb或同质二聚体的错误配对。
用于双特异性模式的细胞系可能需要独特的载体设计或广泛的克隆筛选，以确保多链支架的平衡表达，防止过度错配。此外，双特异性分子本身的非自然性加上其复杂性，对于表达来说是一个不小的挑战，可能会导致更低的单细胞产率和基因拷贝的扩增受限。此外，当表达一种有聚集倾向的结构时，可能会发生内质网瓶颈和分泌受损，进而导致细胞健康下降、生产培养中细胞生长缓慢，产率低下。
灌流细胞培养可用于缓解或降低双特异性产品生产中某些与产物相关的杂质。特别是，灌流培养可降低产物在生物反应器内的滞留时间，防止产物积聚以及浓度增加，这可降低双特异性分子的物理或化学降解。此外，高细胞密度灌流实现的细胞生长、活性和单位体积产量的提升，也有助于提高工艺的经济性。
在本研究中，研究人员评估了灌流培养用于三种类型非糖基化双特异性结构的优势。实验分析了表达6种不同双特异性分子的CHO细胞系，均使用了传统的12天补料分批（FB）工艺以及约40天的灌流（PER）工艺。
材料和方法
补料分批（FB）和灌流（PER）细胞培养工艺
实验使用6种稳定表达非糖基化双特异性结构的CHO细胞系。细胞复苏并扩增，最终接种至生产补料分批（2L – 500L规模）或灌流（2L – 50L规模）生物反应器。
对于灌流工艺，细胞累积期持续8-12天，以提高细胞密度和生物质至设定点70-80pF/cm（以电容探针检测）。灌流培养中的细胞分离使用交替式切向流（ATF）过滤系统，配用0.2μm 聚醚砜过滤器，并使用专利的化学限定培养基。灌流速率逐步增加，并在收获阶段开始时，达到约2VVD。一旦达到生物质设定点，开始收集收获细胞培养液，灌流培养继续进行28天，通过细胞废弃，维持生物质设定点。
详细的实验和分析操作，请参考原文。
灌流（蓝色）和补料分批（红色）中6种分子VCD、活性和滤出产品浓度的时间变化趋势。灌流呈现出更高的VCD和活性以及由于连续的产物滤出而相对较低的产物浓度（N.Gomez，et al., 2020）。
比较PER（蓝色）和FB（红色）工艺细胞生长和产量的主要工艺性能指标：A）最终IVCD；B）总收获产量；C）每日收获液产量；D）总体细胞特异性产率（N.Gomez，et al., 2020）。
结果
总体来讲，研究结果显示，1）相比FB，由于PER可获得更高的细胞密度、活性以及更长的培养时间，所以可提高单位体积产量。平均而言，相比FB，强化的PER工艺可使综合活细胞密度（IVCD）和总收获产物提高15倍（每日蛋白单位体积产率提高5倍）。2）PER产品质量属性更优化，包括更低水平的高分子量（HMW）物质、片段化、酸性电荷异构体以及互补和非互补决定区（CDR和非CDR）中的单个氨基酸修饰（如 Asn脱酰胺基作用以及Asp 异构化作用）。实验也比较了PER和FB培养中，工艺内纯化池中的工艺相关杂质水平，如宿主细胞蛋白质（HCP）水平。结果是，PER培养中的聚体水平降低达72%，裁剪物降低达75%、酸性异构体降低达76%、互补决定区（CDR）中脱酰胺化/异构化物质降低、HCP降低达84%。详细的实验结果和分析，请参考原文。
结论
实验研究了6种表达3种不同类型双特异性结构的CHO细胞系。每种细胞系均以FB和高密度PER进行培养。总结来看，结果显示，相比FB，强化PER工艺的IVCD可提高15倍，每日单位体积产量可提高5倍。在PER中，6种细胞系产量提升的差异主要是由于3个主要因素：A）IVCD（通过生物质设定点和持续时间确定）；B）总体qp以及C）收获产量（以废弃率和收获过滤器筛分确定）。此外，对于研究的分子，PER工艺中的产物质量得到了总体上的提升（如更低的聚体、片段化或酸性异构体），但是提升的程度与分子本身有关。总结来说，强化灌流工艺呈现出更出色的产量和产物质量，原因是产物在生物反应器内更短的滞留时间以及相对较低的产物浓度。
▣ ▣
本文为下文简介，因水平有限，如有不当之处，敬请谅解。完整的详细内容，请参考原文。
原文：N.Gomez, J.Lull, X.Yang, et al., Improving Product Quality andProductivity of Bispecific Molecules Through the Application of Continuous Perfusion Principles. Biotechnology Progress, 2020, doi:10.1002/btpr.2973.
更多阅读
细胞灌流培养：连续生物生产 I & II | Q&A | 经济性分析 | 混合工艺 | CHO | 单抗 | 病毒性疫苗 | 强化工艺 | 规模放大 | 稳态 | 种子扩增 | 高产量收获 | 融合蛋白 | 工艺效率 | 工艺开发 | 一次性使用 | 高细胞密度培养 | 流感病毒 | PBG.PK.2.1 | 两步程序 | Sanofi | 工艺建模 | Samsung | N-1 灌流 | 补料分批 | T细胞治疗 | 逆转录病毒 | HEK293 | 经济模型 | 关键质量属性 | BHK-21 | 寨卡病毒 | 培养基
TFDF™：慢病毒 | 澄清 | Oxford Biomedica | 基因治疗
层析：预装柱适用性 | Q&A | 设计特点 | 装柱质量 | 除病毒验证 | 离子交换 | ValiChrom | MiniChrom | 捕获层析 | CHT | ADC | 病毒样颗粒 | MabSelect Sure | ELISA | 工艺开发 | RoboColumn | Atoll | 规模放大 | NGL-Impact A | Praesto Jetted A50 | CaptivA
UF/DF：基因治疗 | 病毒载体 | 慢病毒 | 水泡口炎病毒VSV | 埃博拉病毒 | 巨细胞病毒载体 | 慢病毒样颗粒 | 细菌外膜囊泡 | SIUS-Gamma | ADC | 纳米颗粒 | 离心 | 腺相关病毒AAV | 聚合物囊泡 | 外泌体 | 澄清 | 脂质体 | 细菌 | 一次性使用 | 平板膜包 | TangenX | 溶瘤病毒 | 痘病毒 | 疱疹病毒HSV | 环境科学 | 登革热病毒 | 呼吸道合胞体病毒RSV | CAR-T | 质粒 | 血红蛋白 | 冠状病毒 | 疫苗 | 封闭系统
SoloVPE/FlowVPE：C Technologies | 实时滴度监测 | 质粒 | mAb | 基因治疗 | 斜率光谱法
透析：中空纤维测试法 | 体内活性筛选 | 动态透析 | Spectra/Flo | 体外溶出 | 透析 | Q&A
XCell ATF® 工作原理
XCell ATF® 简介
关于Repligen