如何提高慢病毒载体生产：贴壁 vs. 悬浮细胞培养
在慢病毒生产中，选择转染方法后，生产的下一步就是包装细胞扩增。如果细胞数量不足，任何优化方法都是无用的。根据培养类型的不同，有不同的扩增方法，最简单的是增加组织培养瓶的总表面积或使用需要使用非贴壁或悬浮驯化细胞的悬浮培养。贴壁细胞和非贴壁细胞类型都可用于LV的生产，但每种方式都有不同的特性需要考虑。在这里，我们介绍每种类型中最常用的细胞系以及其扩增方法。
贴壁细胞培养
HEK293的变种，HEK293T是一种贴壁细胞系，通常使用T型瓶培养，培养基添加10%胎牛血清（FBS）。HEK293T细胞系含有整合的SV40 T抗原，相比亲代细胞系HEK293，可获得更高的LV滴度产量。目的是优化可被转染的包装细胞系细胞总数，以最大限度地提高表达目的治疗基因的LV载体的总产量。传统上，使用T型瓶进行细胞培养，但其不能获得基因治疗所需的LV滴度产量。提高滴度产量最明显的步骤是增加细胞培养表面积。
提高LV产量的最简单方法之一是使用多层培养瓶。HYPERFlask（Corning）透气表面的总生长面积为1720 cm2，允许进行CO2和O2的置换。进行LV生产时，单个HYPERFlask相当于10个150cm2培养瓶，一个HYPERFlask可获得1.1±0.16x10^11总TU，而一个T-150 培养瓶为1.2x10^10 TU。TU/mL也会更高，达2.3x10^8，原因可能是更优化的气体置换。
多层细胞工厂（Cell Factory）也可以用于此目的。细胞工厂系统（Nunc，EasyFill，ThermoFisher）对于提高LV生产来说是更聪明的解决方案，其由多个相互连接的培养层组成，最多可达40层。在更大的细胞工厂版本中，培养表面积相当于170个T-150 培养瓶。10层细胞工厂可用于LV生产的规模放大，每批次可获得50 L病毒原液。在细胞工厂中，HEK293T细胞接种并通过磷酸钙方法转染。纯化后，可获得2×10^9 TU/mL，共6×10^11 TU。最近有报导描述了一种在10层细胞工厂中使用磷酸钙共沉淀法生产和纯化VSV-G假型 LV的方法，该方法也适用于PEI转染。超速离心后，研究获得了10^8-10^9 TU/mL 的LV滴度产量。
HYPERflask、CF（细胞工厂）、 T型瓶仍是临床规模LV生产的良好选择。所有这些方式仍被cGMP工厂用于临床级载体的制备。事实上，Amgen仍在使用更老的滚瓶系统生产Imlygic，FDA批准的第一个基因治疗产品。此外，这些系统也被用于体外基因治疗，尽管其产量有限，难以规模放大，对于体内基因治疗来说通常是不充分的。对于大型工业化规模病毒载体生产来说，需要可规模放大的设备。
最常用于LV生产的2D设备
为进一步提高2D设备的培养面积，唯一的方法是增加同一时间所使用的设备的数量。但是，这种操作非常耗时，且需要大量的人工。生物反应器的发展，特别是固定床生物反应器，改变了这一状态。
iCELLis生物反应器技术(Pall) 基于填充微纤维载体的压实固定床的使用。iCELLis的主要特点是由成千上万的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)纤维提供的大表面积。iCELLis可在cGMP条件下获得大规模、高病毒载体滴度，同时测量并记录pH、CO2和O2水平。iCELLis生物反应器还提供了一个集成的灌流系统，可以在去除代谢物和收获病毒载体的同时，补充培养基。
iCELLis “nano”和“500”型号分别可提供高达4和500 m2的细胞培养面积。iCELLis “500”提供的细胞生长表面非常高，相当于3000个 HYPERFlask。
iCELLis nano生物反应器已被用于临床目的病毒颗粒的规模放大生产，如逆转录病毒、腺病毒以及腺相关病毒载体。2018年，发表了一项利用HEK293T贴壁细胞生产LV的iCELLis nano优化研究。该研究比较了CaPO2和PEI转染方法。PEI获得了最佳结果，支持该方法用于大规模转染。使用2.67 m2低压实生物反应器时，细胞的分布比使用4 m2低压实生物反应器时更好。iCELLis nano有700mL 培养基体积，其灌流系统需要5 - 7 L，获得产物体积为3 - 5 L。通过这种方式，可以获得4.85 x 10^8 vp(病毒颗粒)/cm2以及3.63 x 10^5 TU/cm2。尽管对照培养瓶的单位面积产量高于生物反应器，在此运行中，其总共获得了9.70 x 10^9 TU。对物理性颗粒(或vp)和功能性颗粒(或TU)数量的比较显示，产量在过滤和浓缩步骤中有所损失。
尽管iCELLis 500已经被用于获得大批次的腺病毒载体滴度，但将在iCELLis nano 中进行的LV生产转化到iCELLis 500仍有不小的挑战。Valkama等人在iCELLis nano中取得了非常有希望的结果后，Leinonen等人尝试优化iCELLis 500，以使用lV获得单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)，治疗胶质母细胞瘤。更昔洛韦(GCV)被用作前药，在HSV-TK转染的细胞中获得自杀效应。该系统以正在分裂的肿瘤细胞为靶点，而不影响未分裂的细胞(包括神经细胞和一些终末分化的未分裂胶质细胞等)，因此，在分裂中肿瘤细胞分裂时，TK的活性作用于阻断细胞基因组复制。这种LV基因疗法之前曾使用动物模型用于治疗胶质母细胞瘤。一个低压实的333 m2生物反应器被用于这一目的，并获得了良好的结果。100 m2生物反应器可收获165 L，而333 m2生物反应器仅收获165 L，简化了纯化和过滤步骤。最后，生产了4.35 x 10^15 vp以及2.03 x 10^11 TU。尽管这是一次高规模的TU生产，vp数量存在显著差异，可能是由于难以及时冷却大体积料液，破坏了LV。vp和TU数量上的差异表明需要优化浓缩和纯化工艺。
一年之后，同一小组发表了针对iCELLis 500相应下游工艺优化的结果。目前有多种用于下游工艺的方法，但关于大规模下游工艺的文章却很少。该新工艺包括澄清、浓缩、基于切向流过滤的缓冲液置换以及阴离子交换层析纯化等步骤。使用C8166，一种源于成人T细胞白血病 - 淋巴瘤患者、极易感染慢病毒的人细胞系，可以得到1.97 x 10^9 TU/mL，总产量1.12 x 10^12 TU。
iCELLis不是唯一的固定床生物反应器。Univercells最近推出了一种新的全自动一次性使用固定床生物反应器：Scale-X生物反应器系统。Scale-X生物反应器可提供2.4 – 600 m2紧密螺旋管状排列的聚对苯二甲酸乙二醇酯织物层，并有一个范围为10 – 30 m2的中等规模生物反应器，其只有一种压实水平，并将推出cGMP生产版本。
2019年，Scale-x hydro 2.4m2生物反应器被测试用于生产LV。一个具有一定固定床生物反应器经验的病毒载体生产专家小组进行了这项研究，Scale-X hydro与常用的同等规模LV生产工具iCELLis nano进行了比较。研究人员在Scale-X生物反应器中应用了与iCELLis相似的参数，因为细胞附着的材料在两个生物反应器中是相同的。Scale-X hydro生物反应器的滴度与iCELLis nano相当，甚至更好。Scale-X hydro达到的总产量为2.4 × 10^10 TU以及9.8 × 10^5 TU/cm2，而作为对照的iCellis nano为1.3 × 10^10 TU以及4.7 × 10^5 TU/cm2，两种生物反应器获得的每毫升病毒颗粒数量相似(可达1.11 × 10^11 vp/mL)。在培养基和葡萄糖消耗方面，Scale-X hydro被证明至少与iCELLis nano一样高效。
截止目前，600 m2 Scale-X nitro版本暂未被优化用于LV生产，而如其可以基于iCELLis 500规模放大而来，将可获得与AV一样非常有希望的结果。
优化用于大规模LV生产的固定床生物反应器
悬浮细胞培养
使用需要血清的贴壁HEK293T细胞系会导致在GMP条件下，昂贵且难以执行的大规模LV生产工艺，因为需要大量消耗性物料，如T型瓶、动物血清，同时需要大量的实验室人工以及时间消耗。
为了克服这些缺点，研究人员报道了几种策略，以驯化HEK293细胞培养适应悬浮培养条件。2006年，Segura等人使用了HEK293变种，HEK293E细胞系，表达Epstein–Barr病毒(EBV)核抗原-1。这是第一个用于LV悬浮培养生产的细胞系。他们使用无血清培养基获得了良好的LV产量，并证明了使用3 L生物反应器的细胞培养的可放大性。从那时起，多个HEK293变种被驯化为悬浮生长，以用于LV生产。
Segura等人的结果发表后不久，一种最初开发用于腺病毒载体生产的细胞系（HEK293SF-3F6）被优化用于LV生产，并与Segura等人使用的细胞一样，可适应生物反应器生长。研究获得了约3.5 x 10^11 TU和8 x 10^7 TU/mL的总产量。
Bauler等人最近介绍了使用改良的HEK239T细胞系进行cGMP-LV生产的系统。他们将HEK293T贴壁细胞转化为悬浮生长，而不需要FBS，并将细胞系命名为SJ293TS。SJ293TS证明是一种非常稳定的细胞系，产量可达2±0.4x10^9 TU/mL。相比亲代HEK293T细胞，转化的细胞系的质粒DNA和培养基消耗更低。尽管贴壁培养是LV生产研究的主流，悬浮细胞培养看起来也极具潜力。
相比贴壁培养，悬浮培养有多方面的优势：（i）其生长受限于培养基中的细胞浓度，所以可允许简单的规模放大；（ii）其更容易传代；（iii）其不需要酶或机械解离；（iv）其不需要经组织培养处理的容器以进行培养，仅需要搅拌即可保证充分的气体置换；（v）大多数悬浮细胞系可生长于无血清培养基，这可降低成本、简化下游工艺并降低污染风险。对于生物反应器主题，我们介绍了用于贴壁细胞培养的iCELLis和Scale-X生物反应器的优化。此类生物反应器的主要障碍是可放大性，而在悬浮细胞培养中，这不是一个大问题。在我们看来，LV大规模生产的未来是稳定生产细胞系的悬浮培养。
原文：E.Martinez-Molina, C.Chocarro-Wrona, D.Martinez-Moreno, Large-Scale Production of Lentiviral Vectors: Current Perspectives and Challenges. Pharmaceutics 2020, 12, 1051; doi:10.3390/pharmaceutics12111051.
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