基因治疗推动病毒载体生产，但是哪种载体最合适？

本文节选自《Gene Therapies Push Viral Vector Production》，内容有删减，详细内容，请参考原文。

目前，已有多种病毒类型被研究用作基因治疗中的病毒载体，包括腺病毒、慢病毒、逆转录病毒以及腺相关病毒（AAV）。其中，AAV作为基因递送载体获得了极大的关注，已有研究从多方面探索了AAV的商业化可行性。其它类型病毒的商业化可行性也在持续探索当中，特别是对于需要更大的基因负载、瞬时表达或在基因组中插入目的基因的治疗方法。

载体的潜在机会取决于所开发的基因治疗的类型，总体来说，基因治疗可分为两种类型：体外和体内。在体外基因治疗中，细胞在患者体外被改造，正确的细胞“版本”移植回到患者体内，与体外方式相反的是体内基因治疗，此时，细胞在患者体内被治疗。基因的正确版本被递送进患者身体。

在两种情况中，细胞可以使用携带正确基因拷贝的病毒或非病毒载体处理。通常，AAV和腺病毒主要用于体内基因治疗。相比腺病毒和AAV，基于逆转录病毒的载体的体内转导效率相对较低，但其优势在于稳定整合的能力，从而在分裂组织中形成长期的转基因表达。所以，逆转录病毒和慢病毒最适合用于体外基因递送。每种病毒载体都有其一系列的天然特性，会影响其用于基因治疗或其它特定目的时的适用性，没有适合所有应用的通用型病毒载体，每种载体都有其优势、局限性以及应用范围。

病毒载体机制

病毒载体系统是被“掏空”的病毒，其包装信号（如包装形成病毒颗粒的遗传信号）与目的基因（负载）融合，其它必要元件置于独立的遗传元件中，通常为三个或更多。这样设计的目的是防止形成具有复制能力的病毒颗粒，非负载元件通常称为包装系统，如果执行得当，包装结果应仅形成携带负载的感染性颗粒。这些病毒载体系统的主要目标是达到可能获得的最高滴度，而不形成具有复制能力的变体。

病毒载体系统的最大限制在于其趋向性，即病毒天然感染的细胞类型。感染性通常取决于病毒中存在的囊膜蛋白以及这些蛋白会结合的细胞表面成分。根据应用目的，理想的载体要么具有非常宽泛的趋向性，要么当基因治疗的目标是一种非常特殊的细胞类型时，具有非常狭窄的趋向性（在这种情况中，这也是一种安全预防措施）。一些载体，如腺病毒，具有相当宽泛的趋向性，通常通过囊膜蛋白的工程部分来改造其靶向范围。但是，生物技术公司需要注意的是，这种改变是包装系统的特性，而不是病毒载体。改变载体趋向性的过程被称为假型包装。假型包装的优点是定制目标范围。而缺点是囊膜的修饰可能导致病毒颗粒稳定性下降。

慢病毒载体是逆转录病毒载体的一个亚群，其已经替代了传统的逆转录病毒载体，因为慢病毒载体整合时不需要靶向分裂中的宿主细胞。相比传统逆转录病毒系统，该特点拓宽了慢病毒载体的应用。使用慢病毒载体的优势包括其可携带相对较大的负载，且遗传元件仅在整合后才有“活性”。这使得可相对简单地达到所需的滴度以及获得单个整合元件。而缺点是要较难获得高滴度。此外，每个整合事件本身都构成一次突变，这在基因治疗中，会成为一个安全问题。

相比之下，腺病毒载体不会整合至宿主基因组，所以是一个瞬时递送系统。它们曾被认为在基因治疗中有较大的潜力，但于体内使用时，可能会有较强的免疫反应，这也是为什么它们一般已经不再用于基因治疗方法了。

最后，AAV是一种自身不能复制的“缺陷性”病毒。AAV非常有名，因其是唯一已知的、可形成溶原体的脊椎动物病毒，这意味着它可整合进处于静止状态的基因组，进而被特定病毒通过重复感染而拯救，最主要的是腺病毒（其因此而得名）或某些方式的化学处理（丁酸及其它），AAV的天然缺陷性使其成为一种安全的递送系统。

大多数包装系统会形成感染性颗粒，但不会，至少不经常会，整合进基因组，所以，感染后会形成瞬时表达，如腺病毒载体。病毒可以在一个非常特殊的位点整合进基因组（如“溶原”形式）。但是，这需要对包装系统进行修饰。AAV的优势包括此类载体的相对安全性（对比慢病毒）、相对较低的免疫反应、以及相当宽泛的趋向性。其缺点包括有限的负载、较难达到高感染性滴度和功能滴度、以及较难假型包装。

AAV的商业化潜力

多种不同病毒类型已经被开发用于基因治疗，而AAV因其独特的优势，成为其中最常使用的一种，相比其它类型载体，AAV是非常有前景的一种载体。AAV的优势包括：

• AAV具有载体处理所需的特性

• AAV纯化相对简单，因其不容易因剪切力、酶或溶剂的原因而发生降解

• AAV因其非病原性的特点以及较低的免疫原性，可降低炎症副反应的风险

• AAV可递送约达4kb的基因序列

• AAV可降低治疗性DNA异位整合的风险

腺病毒（AV）是第一个被研究用于基因治疗的病毒载体，但是，1999年，一名患者由于出现免疫原性反应而死亡后，使用AV进行基因治疗的研究被叫停，而其它基因开始被研究，包括AAV，主要是由于AAV更低的免疫原性。最近使用AAV的基因治疗产品的获批，如Luxturna、Zolgensma，使AAV的使用量出现了激增，因其安全性和有效性已获证实。

基于最近产品的获批以及AAV的优势，包括其低免疫原性，事实上，它不会在人体内引起任何疾病 – 而其它一些病毒载体有可能 – AAV可在体内形成长期的基因表达，有潜力感染复制及非复制细胞，且可转导多种组织，目前，AAV已经被认为是体内基因治疗的最佳病毒载体，也被认为是其它应用的潜在递送载体，如基因编辑。

目前，已经对多种AAV血清型进行了研究，其中一些血清型已经进行了成功的临床前和临床试验，且在欧洲和美国获批。这使其成为基因治疗开发的一个非常流行的“起点”，尽管许多血清型的使用仍然存在不小的生产挑战，如较低的产量以及随之而产生的高产物成本。

AAV载体的两个显著优势是大剂量给药时的安全性和目的基因的长期表达（持久性）。这就意味着它们可被用于治疗遗传性疾病，例如脊髓性肌萎缩症和血友病。

生产瓶颈

与此同时，生产商也在应对病毒载体生产的挑战。目前，针对AAV血清型的主要生产挑战之一是贴壁人胚胎肾-293（HEK293）细胞系的使用。使用贴壁HEK-293细胞系进行AAV生产的工艺需要增加产量时只能采用“规模扩展”的方法。生产时，需要使用大量的培养瓶或细胞工厂。而这些系统的规模扩展需要大量的实验室人工操作，也会因为污染而导致更大的失败几率。通过采用用于贴壁细胞生产的固定床生物反应器系统，如Pall的iCELLis或Univercells的scale-X系统，可缓和这些问题。

随着对各种AAV载体上游工艺更好的了解，产量已显著提升，但这可能会给下游带来新的挑战，例如细胞收获液杂质特性的变化，由于每种血清型都有其自身的挑战，所以很多情况下，不能简单地采用即插即用型的平台技术。

最近的一些技术创新，如新型膜和整体柱，可能适合作为捕获步骤，同时也可降低缓冲液的消耗。其它的一些创新，例如用于特定AAV血清型的亲和配基，正在被开发用于这些技术，以进一步增强捕获步骤的分辨率。但是，最大的一个挑战仍然存在，就是如何控制生产过程中空衣壳，即非感染性颗粒的量。对于这一点，可以结合工业4.0以及数据分析和机器学习在生物制药领域的应用，如多元数据分析。这会影响AAV和其它病毒载体的生产。学习上游工艺中的工艺参数如何影响纯化工艺，是良好质量源于设计策略的基础。此外，了解单克隆抗体（mAb）生产工艺强化也是非常有意思的一点。从这里学到的经验教训和开发的技术，对于病毒载体的生产来说，可能会带来相同的好处。

生产后，载体需从大体积的细胞裂解液或培养基中收获，包括生产细胞的收获、用于释放AAV载体的细胞裂解程序、澄清以及细胞性杂质的去除、载体分离和纯化、以及载体制剂和除菌过滤。

由于病毒载体领域仍是生物生产中的一个新兴领域，大多数用于病毒载体分离和纯化的方法基于传统实验室工艺，较难规模放大，也不适合临床生产。尽管此类纯化方法可获得纯化的产物，但较长的生产工艺时间以及复杂性，会显著增加下游纯化工艺的成本，并最终导致产量下降。所以，缺乏用于纯化的可放大平台已经被公认是下游工艺的瓶颈。此外，维持AAV载体生物活性、同时去除料液中存在的宿主细胞或培养基来源杂质及污染物也非常重要。目前，大多数已经介绍的AAV纯化工艺依赖于生产的特定血清型。这就需要为每一种不同的血清型设计新的整体工艺。

基因治疗生产工艺整体上来说是一项费力且复杂的工作，生产方面的挑战包括：

• 无菌性和外源性物质的避免。使用目前生产单元中广泛使用的开放式系统时，很难维持完全的无菌环境。

• 活病毒载体的处理。基因治疗需要使用具有活性的病毒载体，操作和生产过程中需要非常小心，以维持病毒的效力。不正确的操作可能导致病毒效力的损失。

• 原材料。基因治疗产品生产需要的原材料，如生长因子和细胞因子，不是那么容易获得的，而且一般非常昂贵。此外，生长因子需要连续地手动添加/补充到培养基中。这个繁琐的过程会导致出错几率的增加。

• 细胞扩增环境。由于缺乏对细胞扩增阶段进行精确监测的技术，培养大量的细胞是一项极具挑战性的任务。此外，某些细胞对化学转染试剂敏感。而且，由于细胞收获工艺涉及多个步骤，失误的可能性也很高。

• 细胞保存。细胞冻存是保存中的一个主要挑战，因为可用于冻存环境的容器选择性有限，其可能会直接影响细胞活性和质量。

目前，由于体内和体外基因治疗的快速增长，行业存在载体供应的短缺。病毒载体供应的短缺也在于低效生产工艺的压力，以及随着生物安全水平的增加（BSL-2），对特定设施的需求，而这也是目前所缺乏的。提高病毒载体产能的方案涉及结构性和技术性的问题。结合CDMO方面的结构性变革以及设备供应商方面新技术方案的开发，可能可以解决生产挑战。后者必须尽快为小规模和大规模生产提供稳健、可放大、工业化的生产工艺，即降低人工操作，提高自动化。而CDMO市场目前是相对分散的，越来越多的新玩家开始提供载体生产服务。但是，产能仍不能满足当前的需求。产能的增加可解决供应短缺，之后通过企业的并购，CMO行业可能会进一步整合巩固。

开发非病毒基因递送载体

病毒并不是唯一被开发用于基因治疗的递送载体。一个极有前景的领域是细胞的基因编辑，其可回输给患者，以校正基因突变。有些创新公司已经在使用带有核酸酶的向导RNA（如Cas9），以体外修饰细胞，完成编辑。期望未来会有使用该技术的产品获批。

生物技术行业在病毒载体方面已经做了大量的工作，包括优化其转座子、感染率以及免疫副反应，但也有很多工作在关注其它基因治疗机制选择。如果我们看得更远，可以发现有一些新的CRISPR技术正在进入这个领域，其可避免基于病毒的系统的某些缺点。其中的两种方法，碱基编辑（base editing）和先导编辑（prime editing），可以在基因组中引入微小的更改或修正，而不引入外源DNA。碱基编辑有可能根据所用的Cas9/脱氨酶复合物的类型，以确定的模式（G-A、C-T、T-C、A-G），特异性地改变单个核苷酸。而先导编辑使用一个复合到Cas9切口酶的逆转录酶，结合含有RNA模板的延长gRNA，而形成所需的编辑。该过程允许对宿主基因组中的一个“小区域”进行确定的更改，而不会出现显著的脱靶或意外突变。每种基于CRISPR的技术都为在降低潜在免疫反应的情况下，对宿主基因组进行靶向更改，开辟了新的道路。虽然这些方法也有缺点，这一领域还有很多工作需要做，但这已经是一个非常令人振奋的发展了。

基因治疗，包括外显子表达和基因整合，其主要目的是产生持久的效果。目前，病毒载体是最有前景的技术。但其它技术，例如通过哺乳动物细胞系生产的工程外泌体，通过将mRNA递送至目的细胞，也开始显示出他们的能力。

质粒载体是最常使用的、用于将转基因插入目的细胞的非病毒基因递送工具。质粒递送治疗性基因时，修饰较为简单，且可优化其在宿主细胞内的表达。多个克隆位点可整合至单个质粒，从而在限制性内切酶的帮助下，插入目的基因。目的基因整合后，将环状DNA在多个克隆位点上进行切割，之后通过连接步骤，将切割物进行退火处理。这些载体中存在的基因通常被一个启动子序列和转录终止子序列所包围，以在整合进宿主基因组后，进行正确的表达。带有诱导性启动子的质粒被广泛用作基因递送工具，因为这些载体有激活/停止基因表达所需的灵活性。目前，已经开发了被用作载体的多种修饰版本的质粒DNA载体，包括微环和微载体。除了质粒外，还有脂质体、脂质复合物（lipoplexes）、人工合成多聚物（Polyplexes）以及寡核苷酸也可以用于非病毒模式的基因递送。

与病毒载体相比，使用非病毒载体具有安全性优势，因其免疫毒性更低，且成本更低，生产更简单。但是使用非病毒载体的挑战包括较低的效率、更短的基因治疗表达持续时间（即需要重复给药），以及由于组织特异性较低而导致的较差的靶向递送。

原文：F.Mirasol, Gene Therapies Push Viral Vector  Production. BioPharm International, 2020, www.biopharminternational.com.

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