腺相关病毒（AAV）工业化生产的下游工艺

Original XS Repligen瑞普利金 2022-12-21

腺相关病毒（AAV）载体是基因治疗领域最常使用的病毒载体之一，其应用潜力已经在大量的临床和非临床实验中得到的验证。目前，已有多款基于AAV的治疗药物获批上市，但其高昂的价格限制了其被广泛使用，如Glybera的治疗价格为€1,000,000，Luxturna治疗价格为$ 850,000，而Zolgensma更是达到了$2,000,000，一度被称为史上最贵药物。

造成基于AAV的产品价格居高不下的一个主要原因是其工业化生产的多个方面仍未得到全面的优化，特别是如何经济、高效地生产可支持商业化的足够量的AAV仍是需要解决的问题。生物制品的生产过程通常可分成两个阶段：上游工艺（USP），即使用细胞底物生产活性成分，以及下游工艺（DSP），去除工艺杂质，获得具有所需质量属性的产物。对于AAV，虽然USP仍需努力提高产量，但目前更多的瓶颈出现在下游。而随着法规日益严格，且可能以首批获批上市的产品作为基准和参考点，DSP可能需要相应的优化。

AAV 下游工艺的目的和挑战

DSP的目的是从USP产生的杂质中纯化活性成分，以使终产物达到一定的纯度水平，降低患者安全性风险。近年来，有多个表达系统被设计用于提高AAV产率和经济效益，包括基于HEK293细胞的瞬时转染系统、单纯性疱疹病毒1（HSV 1）表达系统以及杆状病毒表达载体系统（BEVS）等。虽然不同系统的选择，可能在可获得的滴度、宿主相关杂质方面有一定程度的差异，但是总体来看，DSP不会因为USP的选择而有显著的变化。

AAV是20-25nm的二十面体，相对较小，且相比其它病毒，非常稳定，所以对于DSP来讲，其有两个显著的优势：首先是载体可通过0.2μm过滤器除菌过滤，便于控制产品的无菌性；其次是AAV可耐受大多数严苛的条件，如剪切、pH变化以及高电导缓冲液等。

而其难点是，首先，大多数USP可获得1E4-5E5vg/cell的载体滴度，相应的，粗收获液中的单位体积滴度在1E10-2E11vg/mL之间。而AAV临床剂量范围为：1E12vg/kg-1E14vg/kg，这就意味着药物底物需浓缩100倍-10,000倍，以达到合理给药体积（静脉输注一般为数ml/kg）所需的滴度。对于临床/商品化生产，如以200L-500L体积生物反应器操作获得的料液需浓缩到100-200mL，只有极少数设备可在GMP条件下操作如此小的体积。AAV载体纯化的另一个挑战是存在空衣壳。在上游工艺中，缺乏载体DNA的AAV颗粒的产生会受到多个因素的影响，如基因组长度、血清型以及表达系统。由于完整和空衣壳物理上高度相似，主要不同在于浮力密度，他们很难通过标准的下游工艺来区分。最后，据报导AAV颗粒会含有源于宿主细胞DNA、辅助病毒和/或质粒DNA的DNA片段，从技术上讲，一个纯化工艺不太可能能分离含有治疗性基因组的衣壳和含于其它DNA片段的衣壳。

工业化AAV下游纯化工艺

AAV纯化的历史方法包括离心和氯化铯等密度梯度离心，另外为避免铯的重金属毒性，已开始替代使用碘克沙醇。等密度梯度离心的优势是可以从空颗粒中分离完整衣壳，缺点是不适合用于商业化的GMP生产，因其可放大性受限。在工业化规模下，可使用其它技术，以实现可放大、可重复的DSP。将多种方法组合，形成包含多个关键步骤的工作流，是大部分生物生产工艺采用的策略。

细胞裂解 & 细胞碎片的去除

尽管有些AAV血清型可在培养过程中部分释放到胞外，但大部分AAV不能从细胞有效地释放。培养液收获时，需要使用细胞裂解技术，回收细胞内的载体，以提高回收率。裂解方法可选择基于去垢剂的化学裂解或机械裂解。在GMP环境中，机械裂解意味着使用的设备需要进行严格的清洁验证程序，这也是去垢剂被广泛使用的原因。

裂解后，收获液将成为含有DNA、蛋白质和细胞碎片的高浊度悬液，所以第一步是去除大部分的此类物料的澄清操作，其目的是收获低浊度的澄清收获液，以免堵塞后续的层析步骤。在小规模下，离心是标准程序，但在大规模生产中较少使用。过滤对于工业规模来说更加方便，包括不同孔隙度的膜过滤器或深层滤器。

使用核酸酶降低DNA

随着Benzonase的商业化，核酸酶处理已经成为生物生产的标准组成，尽管其成本较高，但该步骤可为产品纯化提供多重优势。首先是避免基因组DNA形成聚集体或大分子复合物，降低料液粘度，并防止堵塞过滤器和柱层析介质，另外，将宿主细胞DNA破坏成小片段，降低了终产物中携带全长致癌基因的风险。

核酸酶处理可在工艺步骤的多个步骤中进行。为降低基因组DNA导致的复杂性和粘度，最好在细胞裂解的同时直接加入酶，但除了价格，该步骤还需考虑酶活性与裂解条件的兼容性。另一种方法是可在澄清或层析之后加入，但在这种情况中，酶的优势会被降低，因为大部分的DNA已在此之前的步骤中被清除了。

捕获层析降低工艺杂质

从杂质中分离目的生物制品最有效技术是捕获层析，其将AAV载体以特定的方式结合至基质，并通过动态液流漂洗掉HCP、辅助病毒蛋白、DNA以及包括去垢剂和核酸酶等的其它杂质。由于AAV在其表面有正电荷和负电荷，所以可被离子交换层析（IEC）截留。根据衣壳的等电点和pH，衣壳的总电荷可能是负的或正的，所以可选择使用阳离子交换层析或阴离子交换层析。目前市面上有多种各不同的IEC填料，其中许多被报道可有效用于AAV的纯化。在最常使用的填料中，基于季胺的强阴离子交换剂（如ThermoFisher的POROS HQ）或基于硫丙基的强阳离子交换剂（如GE Healthcare的SP Sepharose）已被报道用于纯化不同的AAV血清型。尽管IEC可有效捕获AAV载体，但是其选择性不高，因为许多杂质可能具有与AAV相近的等电点，使得不需要的蛋白质或DNA杂质被一起纯化。所以，以IEC进行捕获通常需要使用以另一种基质及不同pH和盐离子条件操作的额外层析步骤。

免疫亲和层析是一种具有高特异性的捕获步骤，目前，大部分的商业化亲和填料依赖于针对给定AAV血清型的骆驼抗体VHH片段。VHH片段是以酵母生产的12-14kD多肽，共价结合到填料基质上：琼脂糖或聚苯乙烯-二乙烯基苯（POROS）基球。AVB Sepharose是第一个用于AAV纯化的商品化亲和填料，其最初开发用于AAV1，但对AAV2、3、5、6和AAVrh10也有亲和性。随着对AAV8和AAV9血清型需求的增加，经过对VHH文库筛选，开发了高特异性填料POROS™ CaptureSelect™ AAV8和POROS™ CaptureSelect™ AAV9。此后，ThermoFisher又推出了POROS™ CaptureSelect™ AAVX，该款填料对于目前检测的每种血清型都有极高的亲和性，说明AAV衣壳上存在高度保守的表位，据报导，POROS填料设计有高密度的配基，所以填料的结合载体高达1E14 vg/mL。基于抗体的特异性，免疫亲和填料对污染物的结合极低。且由于其高亲水性，漂洗条件可尽可能严格，以使可能的杂质解吸附。所以，与IEC不同，单步亲和层析即可获得高度纯化的AAV。

Repligen的OPUS®预装层析柱可预装上述所有填料，并提供用于工艺开发和临床及商品化生产的不同规格选择。

精制

在大多数生物工艺中，精制旨在进一步降低杂质水平，特别是HCP。虽然使用亲和层析作为捕获步骤时，可能不需要精制，但精制有利于提高产物质量，特别是去除在洗脱过程中，可能从填料上脱落的配基。精制通常使用IEC或体积排阻层析（SEC）。操作时，IEC可按正向结合模式或反向流穿模式进行。SEC虽然也被成功用于AAV载体，但由于其放大过程更为复杂，在工业生产中，一般不是最受欢迎的选项。需要记住的一点是，在下游工艺中，没有一步可获得100%的收率。所以，在决定增加精制步骤前，建议在产物纯度和工艺收率之间进行权衡评估。

降低空衣壳

AAV载体生产不可避免地会伴随着空衣壳的形成，目前还不清楚其是否有生物学上的意义。但是对于一些临床试验，生厂商一般都会进行特定的步骤，以降低空衣壳的含量。传统方法是基于密度梯度的超速离心，梯度可使用氯化铯或碘克沙醇。尽管这种方法已经被用于GMP IND的生产，但对于工业规模下大体积料液的处理非常不方便，也难以在GMP环境中标准化。另一种方法是使用连续超速离心，以富集完整衣壳，但这种方法需要特定的设备以及只有少数公司才具备的高水平专业知识，且其对于从空衣壳中分离完整衣壳的产量和效率也没有定论。

在工业规模下实现完整衣壳富集的最有前景的选择是离子交换层析步骤。据报导，AAV2空衣壳与含有基因组的衣壳相比，其电荷特性略有差异，继而可能可使用阴离子交换基质进行分离。该方法的复杂性在于空衣壳和完整衣壳的电荷差异非常窄，所以，病毒颗粒的差异洗脱只有通过非常缓慢且平坦的线性氯化钠梯度来实现。成功时，会得到两个彼此非常接近的洗脱峰。峰的接近程度使其很难在大规模条件下进行操作。

总结来说，在AAV制备中，还没有一种可轻易转化到大规模生产的空衣壳分离方法，需要进一步的工艺开发，以进行优化和标准化。

浓缩和洗滤

下游工艺的最后一步是载体浓缩至所需的滴度，并以适合产品稳定性和患者给药的缓冲液进行制剂。切向流过滤是该步骤的标准方法，其可使用中空纤维膜或平板膜包过滤器。AAV是一种无囊膜病毒，耐受剪切应激。这为操作条件的确定提供了一定的灵活性，包括流速、跨膜压以及工艺持续时间。由于载体粒径较小，膜截留分子量不能超过100kD或300kD。TFF的主要技术风险是在高浓度条件下，可能出现AAV载体聚集。只有缓冲液组成，也就是高盐浓度，可改变聚集点，所以，纯度、缓冲液、血清型以及目标滴度是四个在TFF开发中影响关键工艺参数的方面。Repligen是极少数可同时提供中空纤维和平板膜包选择的公司之一。

整体工艺收率

关于临床级AAV载体下游生产工艺中产物收率的报导不多，但一般认为，单个纯化步骤很难达到90%以上的收率，如果5步工艺（澄清、捕获层析、精制、TFF和除菌过滤）中的每一步收率都达到90%，则理论上整体收率将低于60%。如果更加现实一点将，如果每步收率为80%，则整体收率将降至32%。这与已有的报道相当。

总结

目前，提高产量、降低成本，仍然AAV工业化生产的主要的战，因为治疗成本将是未来基因治疗发展的主要障碍。从下游工艺考虑，大部分技术已可支持GMP环境中的大规模生产。但值得注意的是，每一种新的AAV产品都会有新的特性，例如滴度、空衣壳/完整衣壳比以及与血清型相关的吸附和聚集特性，所以，不太可能开发一种适用于所有AAV载体的通用型工艺，或者说，至少该工艺不太可能在所有情况下都是最佳工艺。另外，在不远的将来，可能就会有针对AAV载体的详细质量要求，比如针对空衣壳以及非特异性包装宿主DNA的衣壳的说明，这有助于开发人员开发标准化的、可重复的工艺，以更严格地控制质量。

参考文章：

M.G.Moleirinho, R.J.S.Silva, P.M.Alves, et al., Current challenges in biotherapeutic particles manufacturing. Expert Opinion on Biological Therapy, 2019, https://doi.org/10.1080/14712598.2020.1693541.

M.Lock, M.Alvira, L.H. Vandenberghe, Rapid, Simple, and Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale. Human Gene Therapy, 2010, 21: 1259-1271.

M.Hebben, Downstream bioprocessing of AAV vectors:industrial challenges & regulatory requirements. Cell & Gene Therapy Insights, 2018, DOI: 10.18609/cgti.2018.016.

F.Masri, E.Cheeseman, S.Ansorge, Viral vextor manufacturing: how to address current and future demands? Cell & Gene Therapy Insights, 2019, 2019, 5:949-970.

Repligen产品在AAV工艺中的应用

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