灌流培养中的病毒收获：选择正确类型的中空纤维膜
使用连接基于膜的灌流系统的生物反应器，可在疫苗和病毒载体的生产中获得高细胞密度和产物浓度。然而，由于有些病毒颗粒不稳定，如果不连续收获，可能会丧失其感染性或发生物理性降解，从而导致显著的产物损失，而由于病毒相比蛋白质产物，粒径较大，即使是孔径为0.2μm的中空纤维膜也可能会将其截留在生物反应器内。在此，我们进行了一项系统性的研究，以在过滤器污染以及黄热病毒（YFV；~50 nm）收获方面，对膜结构和理化特性进行表征。在切向流过滤灌流实验中，我们观察到YFV的截留与膜的标称孔径大小关系较小，而取决于由于过滤器污染而形成的实际有效孔径。扫描电镜图像显示，通过选择合适的膜可以显著降低过滤器污染：(1) 平坦的内表面 (低边界滤饼层厚度)、(2) 平滑的材料结构 (减少沉积)、(3)高孔隙度(高跨膜通量)、(4) 明确的孔径大小分布 (良好定义的膜孔选择性)以及(5)较高的纤维壁厚(更大的有效面积)。研究观察到，聚砜(PS)膜过滤器的污染最低。尽管使用小孔径的PS膜(0.08 μm)会将YFV完全截留在生物反应器内，但使用大孔径PS膜(0.34 μm)可以连续收获产物。由于后者的低蛋白截留特性，这种膜类型也可用于其它应用，即灌流培养中重组蛋白的生产。
简介
以灌流模式进行动物细胞培养可以强化病毒疫苗和病毒载体的生产。更高的细胞密度有助于获得更高的病毒滴度。为了将细胞截留在生物反应器内，需要使用细胞截留装置，根据其物理分离原理，一般可分为过滤、沉淀、超声等方式。基于中空纤维膜的系统由于其良好的可放大性、简单性以及高效的细胞截留，目前已被广泛应用于重组蛋白的生产。此外，人们对其用于病毒疫苗生产的兴趣日益浓厚。随着细胞密度的增加，通常会有大量的病毒和其它颗粒被释放到培养基中。与重组蛋白生产不同的是，病毒感染诱导细胞凋亡，使细胞降解并裂解，增加了杂质的总体负担。除了病毒颗粒和细胞外囊泡，大量的DNA和蛋白质也会积累。在连续收获过程中，这会导致膜的有效孔径变窄，最终导致膜堵塞。近年来，大量研究报道了这种不希望出现的过滤器污染现象，即使使用了大孔径的中空纤维膜。在每种情况下，产物截留都与过滤器污染有关，但对病毒收获过程中，膜特性和截留装置性能进行表征的工作还很缺乏。
目前，对下游工艺(DSP)中的膜污染现象已经进行了深入的研究，但对上游工艺(即灌流培养)中使用膜的研究非常有限。然而，作为可以实现工艺强化和连续生物生产的新型生产系统，产品截留得到了越来越多的关注。导致跨膜通量降低、膜阻力增加的膜污染主要有三种机制：
内部污染：与膜相容的颗粒吸附到过滤器材质上，导致孔径变窄（颗粒大小<膜孔大小）；
部分或完整的膜孔堵塞：颗粒或团聚物空间性堵塞膜孔（颗粒大小≈膜孔大小）；
凝胶/滤饼层形成：较大的颗粒吸附在膜表面，随后又被较小的颗粒压实，而形成的额外的溶质层（颗粒大小>膜孔大小）
虽然内部污染通常会使孔道变窄，但膜孔堵塞和滤饼层的形成同样会降低膜的有效筛分，从而导致膜堵塞和过滤终止。中空纤维组件的污染行为与膜特性密切相关，特别是其孔径分布、孔隙度、表面和材料的粗糙度以及膜内表面电荷。整体性能不仅取决于所使用的特定膜材质，还取决于制造程序和改性。由于细胞培养过程的高度复杂性(例如颗粒大小的巨大差异、不同的表面电荷和浓度、以及不同的输运特性)，污染的描述通常限于(半)经验模型。
除了膜的选择之外，还可以建立具体的操作策略，来降低过滤器堵塞的风险，这需要考虑动物细胞的剪切敏感性。首先，是要降低浓差极化以及边界层阻力，提高传质系数，这可以通过提高过滤器内腔的错流流速(例如，使用更高的进样流速和更小的中空纤维内径)或降低跨膜通量(例如，更低的滤液流速和增加膜表面积)来实现。另一种选择是反转切向流过滤(TFF)方向，从而形成交替式(双向)切向流(ATF)。在使用高液流脉冲的给定频率下，这会增加潜在的涡流形成，从而更有效地去除污染物。此外，也可以考虑通过反转滤液流动的方向而实现水力反冲，这可使膜表面的沉积物变得更为松散，而被内腔内流冲走（编者注：但这种方式在工业化系统设计上并不容易实现，而且由于中空纤维膜结构的原因，如反冲控制不当，可能破坏纤维管腔结构）。同样，对此也可以应用快速反转进样流向的方式，即ATF系统。此时，沿纤维的膜段中，平行于膜的液流流向周期性变化，从而在每个泵循环中进行连续的反冲洗。但整体而言，选择污染发生较少、通量稳定、易于维护的膜，以降低水力清洗次数是首要目标。
在本研究中，我们研究了不同的膜材料及其在灌流培养中通过滤液连续收获病毒颗粒时的特性。为了覆盖各种不同的商业化中空纤维膜，研究测试了聚醚砜(PES)、改性聚醚砜 (mPES)、聚砜(PS)、混合酯(ME，由醋酸纤维素和硝酸纤维素组成)和聚乙烯(PE)膜。如果可行，每种材质研究两种孔径(基于标称截留分子量)在培养期间截留或收获病毒颗粒的特性，并了解过滤器污染与孔径的关系。这就产生了一组八根中空纤维组件的样品。
研究首先从其潜在的污染行为方面对不同的中空纤维膜进行了表征。第二步，我们在TFF操作模式中，测试膜过滤器污染以及病毒颗粒收获。为此，将悬浮驯化的BHK‐21细胞培养在带有外部TFF细胞截留装置循环回路的生物反应器中，随后，细胞感染黄热病病毒(YFV;~ 50 nm)。利用跨膜压力传感器实时监测过滤器污染，同时对滤液中的病毒颗粒、DNA和蛋白质浓度进行检测，以将膜结构检测与工艺性能相关联。
在灌流培养过程中降低过滤器污染的方式。(a)典型的单向流(TFF)可以通过进样流速的提高/脉冲，来降低污染(绿色点箭头)。(b)液流方向反转以去除污染物的双向切向流动(绿色双箭头)。(c)水力反冲可通过反转滤液液流(红色双箭头)实现。对于特定的膜长度和隔膜泵，如Repligen公司的XCell ATF，也可实现沿膜反向跨膜流动(蓝色箭头)的类似效果。
以切向流过滤（TFF）模式，检测过滤器污染和病毒截留的研究中所用的中空纤维膜组件，出于保密协议，供应商名称和标称孔径规格为披露。
膜过滤设置和实验
悬浮驯化的BHK-21细胞使用无血清基础生长培养基培养于2.5L 玻璃生物反应器。细胞以MOI 10^-1感染YFV。所有膜用去离子水润湿，随后排干，并连接至罐外以蠕动泵为驱动的循环回路。先后依次测试不同的膜，固定剪切率为2000 S-1，即根据每根组件所有纤维的横截面积，调节单位体积流速Vf（ml/min）：
其中，fn为中空纤维数量，r为纤维内径（mm）。滤液泵设置滤液通量J约为33 L/hr/m2，即滤液流速Vp与组件内所有纤维的总过滤表面积A（m2）之比：
J=Vp/A
滤液返回至生物反应器。入口、出口和滤液压力使用在线聚砜压力传感器（TC或鲁尔端口，Repligen，产品编号ACPM-799-01N）检测。传感器连接至数字压力监测器或蠕动泵控制器（KR2i系统，Repligen），以5秒采样间隔记录数据（KF Comm合规工作簿）。总阻力（R，m-1）基于Darcy法则计算：
R=TMP/ηm·J
其中，TMP为跨膜压力（mbar），ηm为介质的动态粘度（0.69 mPas @ 37℃）。TMP为膜两侧液流的压力差。每根膜的单位面积滤液体积Vp（L/m2）计算为
Vp=V/A
V为最高滤液体积（L）。
详细实验操作和结果讨论，请参考原文。
不同中空纤维材质膜内表面的扫描电镜图。2000倍放大可直接比较未使用新膜的粗糙度、表面结构和孔隙率。ME：混合酯；mPES：改性聚醚砜；PES：聚醚砜；PE：聚乙烯；PS：聚砜；SEM：扫描电镜。
以切向流过滤模式进行的灌流操作中的中空纤维膜阻力。膜使用含有病毒感染的BHK‐21细胞的培养液挑战，恒定滤液通量为33 L/m2/hr。过滤阻力(蓝圈)随着单位面积滤液体积的增加而增加，直到达到最大污染物载量。用样条曲线拟合数据点，以可视化研究膜污染的进展。红色竖线表示膜完全堵塞前的最大单位面积滤液体积。
在灌流操作过程中，使用不同中空纤维膜进行连续病毒收获时，滤液中的黄热病病毒(YFV)滴度。用YFV感染BHK‐21细胞，并以切向流过滤模式，先后测试不同中空纤维膜。绿色水平线表示生物反应器罐内的感染性病毒滴度 (9.0×10^4 PFU/ml)。红色虚线表示膜完全堵塞。
灌流操作中，以不同中空纤维膜进行连续病毒收获时的DNA和蛋白质截留。检测了在基础生长培养基中生长的感染BHK‐21细胞上清液的污染物水平。从生物反应器罐和滤液中提取DNA和蛋白质检测样品。DNA(绿圈)和蛋白质(蓝圈)浓度以截留系数表示。红色虚线表示膜完全堵塞。
总结
我们的结果突出了选择正确的膜进行病毒强化生产和连续产物收获的重要性，膜材料及其相关的结构和理化性质是形成导致产物截留的过滤器污染和“真实”膜孔径的决定性因素。孔径0.34μm 的PS膜对YFV颗粒有较高的滤过性，并有可能实现连续产品收获。基于此结果，可以进一步研究不同的工艺条件(如流速和滤液通量)以及过滤操作(如水动力反冲、反流方向和脉冲流)，以优化灌流工艺的性能。
原文：A.Nikolay, J.de.Grooth, Y.Genzel, et al., Virus harvesting in perfusion culture: Choosing the right type of hollow fiber membrane. Biotechnology & Bioengineering, 2020, DOI: 10.1002/bit.27470.
相关阅读：