病毒载体过程分析技术的最新进展
本文节选自《Recent evolution in Process Analytical Technology for viral vectors》，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
近年来，随着基因治疗领域不断变化的需求，过程分析技术(PAT)在病毒载体生产中的应用能力也在不断发展。
四五年前，可获得的腺相关病毒(AAV)载体产品表征分析是基础的，缺乏准确性、通量和标准化。该领域仍处于相对起步的阶段，面临着AAV生产的复杂性以及AAV病毒颗粒物理特性的挑战。AAV的大小大于小分子和抗体，但小于较大的病毒(例如，通常用于疫苗的病毒)，这意味着它处于分析能力之间，阻碍了基于这些分析的标准化和质量控制。因此，最初的重点是提高可用离线分析技术的准确性，以便更好地理解产品。细胞和基因治疗弹射器（Cell and Gene Therapy Catapult，CGTC）的职责是鉴别市场上的挑战，并解决这些挑战，以推动行业向前发展。在这个阶段，团队与治疗开发商合作，创建针对性的分析方法，以支持连接到临床试验。
一旦实现了离线分析技术的改进，加速数据周转的动力将来自工艺开发。在一个越来越追求激进的开发时间线的领域，对分析的需求是能更快地反馈到工艺，以实现更快的开发。因此，在关键属性列表中，包括了速度、通量以及准确性。
当速度问题得到解决，重点再次转移，这一次转向开发预测性和规范性的分析。基因治疗开发商不仅想知道在这个工艺中会发生什么，而且还想知道他们能确保它会发生。这就把我们带到了今天的局面，这个领域的主要驱动力是数字化。目前，我们看到，用于在线监测病毒载体制造的新技术和传感器正在蓬勃发展。
这一进化过程也反映在CGTC分析开发团队的工作中，该团队已经建立了细胞和基因治疗(CGT)产品的标准分析表征平台，并实现了自动化；通过实施颠覆性的新技术，提高了数据生成的准确性和速度。此外，团队还投资建立了一个综合性的诊断数据包，能够在整个生产过程中了解产品行为。目前，团队还在继续与技术和治疗产品开发商进行合作，寻找并实施新的在线传感器，用于在线表征和生物工艺控制。
围绕引入新型分析能力的挑战 & 考量
虽然不断发展的新型分析技术在精度和通量等方面取得了所需的进步，但这一过程并不总是一帆风顺的。
例如，目前使用的金标准AAV参考物料最初依靠qPCR进行载体基因组滴度检测。然而，使用这种方法生成的数据会因实验室而异。为了解决这一一致性问题，行业开始采用数字液滴PCR(ddPCR)来量化剂量 - 这是基因治疗的一个关键因素。ddPCR的优点是对抑制剂不敏感且不依赖标准曲线。它给你一个绝对的定量，因此，可获得最高的精度。
在这种情况下，从qPCR到ddPCR的转变相对容易，且挑战性相对较低 -这是一个容易“销售”的方法：用一种简单的替代方法进行直接的替代。这是一种合理的替代方法，也是一种可行的方法。
然而，事实证明，转移到一些更新的技术将更具挑战性。例如，CGTC目前用来评估聚集的动态光散射，主要是为了提高速度而引入的 - 它可以快速提供颗粒大小的检测，由此可以推断聚集的程度。团队面临的问题主要与验证该分析方法的需求有关，以便将它用于放行检测。
可比性是进一步的关键考量因素：使用新方法生成的任何新输出值都必须与之前的表征数据进行比较，而且，观察到的任何差异都必须向监管机构解释。
最后，重要的是要考虑到新型分析工具对样品的需求。目前许多可用的工具需要使用大量的载体产品，这将大大提高分析的成本。例如，用于空/完整载体衣壳定量的分析型超速离心和CryoTEM分析都需要高浓度且大体积的AAV载体产品。因此，CGTC的团队现在正在与合作伙伴一起研究一种质量光度分析（mass photometry assay）方法，这种方法需要相对少量的载体产品，即可生成快速且准确的空/完整衣壳分析数据。
将在线PAT用于病毒载体生产的进展
在分析自动化和在线整合方面正在取得进展，特别是在上游载体生物工艺的技术和传感器开发领域。对于基因治疗领域来说，这是一个相对容易实现的目标，因为许多技术都是从抗体领域转移过来的，这意味着已经有了高水平的技术知识和支持，可以加以利用。
然而，也许在线自动化分析技术发展的最大发展是在下游。新技术正在市面上涌现，可以实时提供纯化步骤、滴度检测、纯度和粒径的实时读数。
目前病毒载体纯度分析的局限性
目前的病毒载体纯度检测系统并不是最佳的，这对该领域是一个巨大的挑战。
在这个领域，表征工具也有局限性。CGTC正在通过开发一种自下而上的方法来识别和量化工艺相关的残留，从而提高能力。例如，对于DNA相关的残留，团队正在向下一代测序(NGS)领域迈进，该技术允许对存在于载体产品中的任何非载体DNA进行测序和鉴别。团队还使用了基于LCMS的方法来量化蛋白质残留。
成功利用这些杂质检测方法的下一步 -实际上，包括前面讨论的在线自动化下游分析工具-将是对它们进行验证，以便能够应用于过程中控制。
需要标准化
病毒载体表征标准化的缺乏继续阻碍着基因治疗领域的发展。这个问题的很大一部分是由于全球范围内缺乏针对基准分析输出的标准材料。
CGTC最初试图通过使用内部生成的参考物料来开发我们自己的分析方法，以解决这个问题。这些物料随后与合作者共享，以解决不同地点和不同技术之间的可比性问题。CGT现在全球舞台上迈出这一步，探索与标准材料生产商的合作，希望创造一个经认证的标准材料，具有充分的表征，可以用于跨行业的基准分析输出。
原文：T.B.Kheir, Recent evolution in Process Analytical Technology for viral vectors. Cell & Gene Therapy Insights 2021; 7(6), 913–916.
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