针对细胞/基因治疗产品的分析方法开发策略
本文节选自《Development Strategies for Cell and Gene Therapy Methods》，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
随着基于细胞的方法不断发展，支持基因疗法通过基因或蛋白质表达来评估产品的效价，分析结果的复杂性和多样性的提高，可能会给方法开发和分析的最佳实践策略带来挑战。据FDA称，细胞和基因疗法(CGT)的研究型新药(IND)申请在过去几年中经历了快速的增长。从1995年到2015年，每年大约有50个相关的申请，但在2016年到2020年，这个数字增加到300多个申请，证明了CGT产品快速发展的行业趋势。事实上，自2015年以来，FDA已批准了多种类型的病毒疗法用于商业化使用，包括单纯疱疹病毒、腺相关病毒(AAV)、慢病毒和逆转录病毒。
随着生物技术行业进一步进入基因治疗领域，我们必须承认生产和临床过程的变化。基因治疗的开发时间在效价和滴度测定方法的建立方面缩短了一半，且与工艺开发进一步重叠。自体和异体细胞治疗有不同的生产工艺，导致了不同的、基于细胞的检测方法，且随着我们从数据中了解得更多，而在不断地演变。考虑到工艺变化通常与效价和滴度测定方法的变化相关，持续收集数据并审查趋势数据，以确认工艺变化对这些结果的影响，对于保持可接受的方法性能来说至关重要。
分析类型
病毒介导的基因治疗的作用机制可通过多种方法来衡量，其中一个基本方面是病毒的感染性，这是其递送治疗能力的核心。多种检测方法可用于检测感染性，如菌斑检测、病灶形成检测和组织培养感染剂量50(TCID50)。要在GMP环境中使用这些检测方法，其检测过程必须客观，并且在统计上可靠。
TCID50方法满足这些考量，其通常以96孔板形式执行，这有助于提高其通量。这种方法检测病毒感染性时通过稀释方案反算起始滴度，即基于病毒感染细胞的统计频率为50%时的稀释，通常使用诸如定量聚合酶链反应(qPCR)或液滴数字聚合酶链反应(ddPCR)等方法检测病毒核酸。鉴于TCID50方法的多样性，在试验开发中必须做出多种选择，以创建最适合需要进行滴度检测的病毒和最终用途的试验方法。
首先，必须选择一个允许病毒复制的细胞系，对于复制缺陷型病毒，需对特定的细胞系进行工程处理。例如，对一个复制缺陷型AAV进行滴度测定，需要可表达AAV的Rep和Cap基因的细胞系，以诱导生产性感染。其次，必须设计一个适合药品状态的稀释方案。稀释范围越宽，测定的滴度范围就越大，尽管这将牺牲一定的准确性。在TCID50中使用10倍稀释很常见，可以获得范围较宽的分析，甚至可达到预期值的10%至1000%。然而，由于水平之间的巨大跳跃，统计数据受限，会产生不准确的结果。TCID50方法使用较低稀释幅度的方案时，结果更准确。对于正在进行生产优化的药品，应保持较宽的范围，而处于后期阶段的产品，使用较窄的稀释步幅以获得更准确的结果，将更有益。
也许在开发TCID50方法时最常见的争论是应该使用什么读数。可以选择任何可以区分感染孔和未感染孔的方法，但需要考虑以下几个因素。首先，检测技术必须能够识别出具有新病毒复制的孔。缺陷病毒颗粒可以感染细胞，甚至表达蛋白质。因此，方法应依靠子代病毒的产生。第二，被测量的信号应该尽可能接近病毒的复制。依赖于病毒复制的次级效应，如细胞死亡等，可能会引起误解。第三，测量应该客观。许多传统的TCID50方法依赖于显微镜和人工识别病毒灶。这种方法可能产生不同的结果，取决于分析人员读取的分析结果，导致数据的不确定性。
最后，检测方法不需要过于敏感，应注意避免过于严格的系统适用性，以防止假阳性。理想的检测方法是在不检测接种物或非生产性感染的情况下，给出孔是否感染的可重复阈值。由于用于计算TCID50值的统计模型仅依赖于，针对感染病毒，检测孔是阳性还是阴性，所以在重复中精确的基因组拷贝数没有影响。
细胞和基因治疗的分析要求
CGT产品旨在诱导与治疗效果直接相关的细胞反应。这种反应通常以靶细胞和组织中的蛋白质表达或修饰的形式出现。虽然了解病毒的行为是治疗过程的重要组成部分，但这种行为如何转化为治疗效果是决定药物疗效、剂量以及最终患者反应的关键。
效价测定是一种直接测量病毒感染的目标结果的方法。尽管效价测定在药物开发中已经使用了几十年，在CGT产品中的应用却是最近才发展起来。由于作用机制和生产过程的复杂性，CGT产品对此类分析提出了特异性的挑战。由于细胞系、供体和病毒复制中的错误，CGT产品往往具有更高的变异性。这些产物也可能存在稳定性方面的局限性以及来自多个表达基因的潜在干扰。
FDA已经发布了开发效价分析方法的建议，以支持细胞和基因疗法的药物生产过程。因为效价分析对于每个产品来说都有其特殊性，所以，药物开发商或合同研究机构(CRO)有责任确保分析方法是药物作用机制的真实代表，并遵循最佳的统计和实验室实践。
效价分析测量产品的强度或治疗活性，是产品一致性测试、可比性研究和稳定性测试的一部分。总的来说，这些测试在临床研究的所有阶段测量产品质量和生产控制，并确定是否有任何可导致不利影响的生产变化。旨在进行表征病毒特征的分析通常侧重于核酸分析，如qPCR、测序或ddPCR，而效价分析侧重于病毒转导或感染的结果，其通常基于蛋白质修饰、活性或生产，而确定基因表达。例如，病毒可能会改变免疫细胞，使它们表达出能够识别肿瘤细胞的新型受体，从而产生针对特定疾病的“定制性”免疫应答。建议在开发旨在衡量这种修改的结果的效价分析，在后期以细胞为基础，以更好地证明生物活性。
常见的效价分析包括酶联免疫吸附分析 (ELISA) 平台，其中，识别特定蛋白质或蛋白质修饰的抗体可用于检测细胞裂解液、固定的完整细胞或固定的透性化细胞中的分析物。ELISA可提供有关特定分析物生产的非常有价值的定量信息，但不能测量蛋白质的功能，因此，通常会与基于功能性细胞的分析方法相结合，以解决数量和功能问题。
由于定性上的局限性，Western blot被认为不如ELISA有效，但仍可用于在病毒转导或感染后，从细胞裂解物中检测蛋白质生产。如果载入了一个已知量的蛋白质，并且其强度可以使用软件检测像素来进行，即可进行半定量的测量。然而，与ELISA一样，蛋白质的功能不能通过此方法来确定。
配体和受体结合分析可用于评价药物的作用机制以及与细胞受体的相互作用。CGT产品在信号转导中引起响应，并在对照标准制备和布局、细胞表面受体、细胞系和特异性方面进行了与抗体相当的优化。配体和受体分析及其随后的读数可获得可量化的功能性输出。受体可以在没有结合的情况下诱导反应，或者，在结合后可能不会发生信号转导，因此，对其水平的严格检查是必要的。
酶活性分析可提供细胞感染或转导后的功能性读数，并显示CGT产品的预期生物活性，即其旨在取代错误折叠的酶或这些蛋白质的全面补充。但需要证明CGT载体的酶活性与其读数之间的剂量-反应关系。
检测效价
FDA要求在从生产商放行任何批次产品之前进行效价检测。尽管是强制性的，但FDA在确定每种产品的测量时允许了相当大的灵活性。然而，所有效价检测都必须符合CGMP的最低标准，例如指示产品特定的生物活性，提供定量数据，满足预先定义的验收标准，包括适当的标准物质和对照。
FDA还提出了一定的要求，如通过方法验证建立准确性、灵敏度、特异性和重现性。由于CGT产品的复杂性，FDA推荐一种步进式的方法来实施效价分析，并认同效价分析可能随着产品的开发而发展。
作为审批程序的一部分，CGT产品的生物特性必须被充分理解。FDA建议除了批次放行的常规检测外，还应检查多种属性。这些属性可用于帮助开发稳健的药效分析，以证明特定的作用机制，以及产品的哪些成分对观察到的效果起作用。
FDA也有一些关于如何使用参考物质和对照品的建议。如果可能，应使用特定于产品的内部参考物质，如良好表征的临床批次。如果适用，也可以使用商业化可利用的物料，如腺病毒5型逆转录病毒载体和AAV 2型载体。所有用于效价检测的标准品都必须确定基于数据的有效期和适当的复验日期。
在过去的十年里，药物开发的重点已经从单克隆抗体(mAb)治疗转移到基因治疗。与单克隆抗体等传统产品相比，细胞和基因疗法的效价测定具有更多的挑战，但我们可以从以往的经验中吸取许多教训。由于单抗治疗和基因治疗之间的传统药效分析方法的相似性，美国药典(USP)生物分析章节，特别是<1032>生物分析的设计和开发，提供了指导，其在评估基因治疗药物的方法开发中仍然很有价值。
在CGT方法中存在类似的偏差和变异来源，因此在优化过程中也应类似地加以考虑。新的检测设计带来了不同的方法，以评估稳健性和固有的变异，这可能会使观察效价或感染性滴度的变化变得更加困难。感染性方法仍有建立最佳实践的空间，以在范围和敏感性之间取得适当的平衡。由于工艺和方法的开发在时间线方面，现在比以往重叠得更多，因此也必须更加密切地关注是谁在驱动方法性能的变化，以优化方法。
在进行方法确认和验证时，应进行适当的实验设计。细胞系和效价测定的类型应该被选择用于证明作用机制和生物活性。分析方法应该是线性的、精确且准确的，但是分析标准应该建立在健全的统计分析的基础上，同时保留一定的阶段适用性，以针对后期阶段产品使用更严格的标准进行研究。
原文：C.Liloia, B.Ziehr, D.McVicker, Development Strategies for Cell and Gene Therapy Methods. BioPharm International, BioPharm International-06-01-2021, Volume 34, Issue 6
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