针对病毒载体的工艺优化和先进平台：分析
本文节选自《Optimization of Processes and Advanced Platforms for Viral Vector Processing》，详细内容，请参考原文。更多内容，请查看“针对病毒载体的工艺优化和先进平台”。
今年的会议包括了几个关于病毒载体表征以及关于空衣壳和完整衣壳颗粒鉴定和量化的演讲。Franz Schnetzinger (Gyroscope Therapeutics)作了题为“The Case for rAAV Titration By HPLC”（通过HPLC进行rAAV滴度检测的案例）的演讲。他的公司通过诱导补体因子1的表达，开发针对老年性黄斑变性(AMD)的治疗方法。他讨论了一种计数基因组衣壳滴度的AAV载体研究。实现这一目标的传统和成熟的方法包括使用定量聚合酶链反应(qPCR)、数字PCR (dPCR)和ELISA。但正如Schnetzinger所解释的那样，这种方法“存在固有的局限性，包括大量的样品制备。”他的研究是为了确定高效液相色谱法(HPLC)是否可以作为替代方法。
结果表明：使用离子交换(IEX)和体积排阻色谱(SEC)的HPLC的结果与基于PCR和ELISA方法具有良好的相关性。HPLC-IEX还能测定基因组滴度，并估算完整颗粒与空颗粒的比率。在他的研究中，IEX被用作在这些比率中发现异常值的一种筛选方法。Schentziner展示了HPLC-SEC衣壳滴度测定方法的样品稳定性和线性结果。他证明了多达70个样本的准确和精确定量，所以证实了该方法的稳健性。而且由于HPLC比传统方法需要的样品制备步骤更少，操作员的差异性也可最小化。然而，Schnetziner指出，HPLC-IEX方法最好用于纯样品，因为结果可能会被杂质干扰。他的结论是，该方法被限制为过程中的筛选工具，而不是质量控制:“相对定量需要精确的参考，是所有因素中最具局限性的因素。”
Michael J.DiBiasio-White (Ring Therapeutics)介绍了“Emerging Upstream Bioprocessing and Analytical Tools for Vector Manufacturing”（用于载体生产的新兴的上游生物工艺和分析工具）。他指出了工艺开发中的一些关键瓶颈:规模放大(或规模扩展)、转染效率、质粒需求、转移到生物反应器的工艺开发研究，以及确定这些研究需要哪些分析。贴壁培养系统的载体生产通常只有有限的可放大性，产量低，且批次间的差异性大。理想的生产系统需是稳定的生产细胞系。“该领域的很多人都在致力于此，我认为这将是病毒载体生产和生产领域的下一个技术进步。稳定的生产细胞系系统是“我们实现目标的黄金标准”。
DiBiasio-White表示，该行业正在进行技术改进，并描述了AAV生产细胞系应该有的样子。特别是，该系统将包括在幼仓鼠肾细胞(BHK)或HeLa细胞中稳定编码的AAV2rep和AAV2cap的转基因，并引入辅助病毒以及激活载体的生产。另外，可以使用基于杆状病毒感染的系统。这两种平台都可克服贴壁培养系统的局限性，因为它们易于放大，只需要很少或不需要质粒，并且可以产生满足商业需求的载体产量。
DiBiaso-White强调了在工艺开发分析方面的进展，并表示该行业正在进入高通量工艺开发时代，包括优化的培养基和补液、使用基于灌流的系统、过程控制和在线或入线分析。他说:“了解上游工艺的变化如何影响载体属性是至关重要的。”他预测，“未来的病毒载体生产将转向自动化和过程控制策略。”更严格的过程控制和实时纠正的能力将增加价值。”
David Dobnik(斯洛文尼亚国家生物学研究所)介绍了“Exposing the Content of Different AAV Fractions After Ultracentrifugation.”（超速离心后不同AAV组分的含量解读）。他的案例研究使用了超速离心后带有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的AAV的不同组分：两种类型的病毒基因组(自互补和单链AAV)和CsCl超速离心获得的四种组分(空、中间、完整和重颗粒)。PCR和ddPCR分析结果显示，所有组分均含有载体基因组，但“重”和“空”组分的数量明显较少。采用透射电镜(TEM)和衣壳酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组分中颗粒的百分比。非靶向高通量测序(HTS)用于鉴定载体样本：一种用于病毒基因组测序，另一种用于全载体构建的测序。HTS方法也被用来评估基因组和鉴定核酸杂质。最后，Dobnik讨论了优化的单分子测序技术，以获得更多的表征信息。
Qin Zou (Pfizer)作了题为“Holistic Characterization of AAV Capsid Particle Using Advanced Analytical Tools”（使用先进分析工具对AAV衣壳粒子进行整体表征）的演讲。他指出，AAV2衣壳比IgG抗体复杂得多，因为衣壳更重、更大。颗粒含量(空、部分或完整)是病毒衣壳颗粒的一个重要理化性质。Zou介绍了检测AAV衣壳及其在溶液中行为的分析方法。一个令人兴奋的工具是分析型超速离心(AUC)，它可以通过不同的方式使用。Zou提供了两个应用的细节：边界沉降速度和等密度梯度平衡。他展示了多波长UV检测的结果，其可用于鉴别空衣壳、部分衣壳和完整衣壳，并提供“基于消光系数的直接和绝对定量”。“另一项研究使用了等密度离心平衡法，它根据颗粒的密度分离颗粒，多波长分析提供了不同衣壳的鉴定。结果表明，与传统方法相比，完整和空衣壳的识别分辨率更高。利用沉降速度(SV) AUC和沉降平衡(SE) AUC结果，研究人员使用Svedberg方程确定颗粒质量。Zou还用核磁共振(NMR)分析研究了磷-31的DNA释放。结果表明，核磁共振可以直接检测DNA，但反应速度慢，灵敏度不高(包封的DNA对核磁共振不可见)。最后，Zou展示了利用外源荧光分析基因组DNA释放的结果。他们证明，这种方法“快速、简单、灵敏，但可能依赖于染料结合。”
原文：M. Rios, Optimization of Processes and Advanced Platforms for Viral Vector Processing. BioProcess International, 2020.
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