针对病毒载体的工艺优化和先进平台
本文节选自《Optimization of Processes and Advanced Platforms for Viral Vector Processing》，详细内容，请参考原文。
病毒载体是几乎基因治疗的同义词，因此它们的开发、生产和处理对所有基因治疗研究人员和生产商来说都是最重要的。每年，我都期待着参加在波士顿举行的细胞和基因生物工艺和商业化大会（Cell and Gene Bioprocessing and Commercialization conference），并与业界和学术界的领袖们谈论他们目前推进基因治疗的方法。像去年的大多数其它会议一样，这次会议完全是在线的，而且必须缩短日程。尽管如此，还是不乏有趣的演讲、全体会议、演讲小组，甚至是实时的在线实验室参观。在会议期间，五个会议中的两个聚焦于体外和体内基因治疗的进展和当前关注的问题。下面，我将重点介绍一些我最喜欢的演讲和演讲者小组讨论(按主题)。他们集中探讨了实施新技术和战略，以减少时间和成本以及改进现有方法的当前步骤。许多演讲者谈到了测序和筛选的高通量应用，优化生产平台以提高产量，改进转染方法，或支持性分析，以表征和鉴别慢病毒和腺相关病毒(AAV)载体和衣壳颗粒。
病毒载体生产
Nicole Nuñez (Eureka Therapeutics)做了题为“Optimizing Viral Vector Production”（优化病毒载体生产）的演讲。她概述了她的公司在转基因递送系统以及慢病毒生产方面的策略。该公司优化了质粒设计、慢病毒生产工艺和质量控制方法，使之成为一个可规模放大的高滴度载体生产系统。一些公司使用p24酶联免疫吸附分析法(ELISA)的物理滴度来测定蛋白质(这种方法不提供载体性能的指示)。而Eureka Therapeutics开发了一种慢病毒载体功能滴度测定方法来检测蛋白质表达，并评估活性慢病毒颗粒、批次间一致性以及效力。Nuñez突出介绍了Eureka的其它优化决策，包括使人类胚胎肾(HEK) 293T细胞在无血清培养基中悬浮培养，以简化规模放大过程。“第三代慢病毒载体质粒系统”用于将遗传元件分离到三个辅助质粒结构上，将转基因定位于第四个单独的递送载体上。该系统还删除了长末端重复序列，以确保自激活。在她的演讲中，Nuñez也强调了转染步骤的重要性。考虑因素包括试剂的选择、孵育时间和培养基、转染期间的细胞密度以及DNA与聚乙烯亚胺(PEI)的比例。最后，她强调了慢病毒载体的监管前景，并在终产品功能性滴度以及可治疗的患者数量方面，将她的公司的生产工艺与其它开发商进行了比较。
（相关阅读：1. 慢病毒大规模生产的下游工艺；2. 在GMP环境下进行临床I/II期慢病毒载体生产；3. 慢病毒基因治疗的规模化生产；4. 如何提高慢病毒载体生产：贴壁 vs. 悬浮细胞培养）
优化生产步骤也是两个专题讨论会的主题，题目都是“High-Throughput Applications in Production Platforms and Enabling Manufacturing Technology”（生产平台中的高通量应用和生产技术的实现）。第一个小组由Rachel Legmann (Pall)领导，组员包括Sam Wadsworth (Ultragenyx)、Thomas Krell (Takeda)以及Jayanthi Grebin (Colder Products Company)。一个关键的步骤是培育出高产量的细胞系。与会者被问及他们对加快这一步骤有何建议。
Wadsworth建议该过程应尽早开始。“你需要开发一种典型的、基于高产量筛选的细胞系筛选模式，并迅速跟进产品的其它关键质量属性。加快这一过程的唯一方法是首先以一种有效、快速且准确的方式，开发这种筛选方法。”
另一个问题与确保病毒控制，以防止污染有关。专家小组成员被要求就基因治疗的主要挑战- 与单克隆抗体(mAb)相比 – 即针对潜在的外源性病毒的除病毒过滤器的验证方面作出评论。Krell说:“如果你选择了一种可行的方法，那么在基因治疗制造中应用除病毒过滤器就没有那么大的挑战。对于不同的基因治疗载体，上游病毒屏障是完全可行的。这实际上比单克隆抗体更容易，因为病毒载体的工艺体积通常要小得多。而在下游，有中等大小的纳米过滤器，允许这些载体的通过，并仍然截留外源性病毒。”
但慢病毒载体的病毒清除可能比其它病毒载体更困难。Grebin指出，慢病毒(与体外治疗相关)的纯化更具挑战性，因为它们比AAV等体内治疗用病毒大。所以0.2 µm过滤器可能不能用于慢病毒载体。“我认为我们的双手被我们使用的病毒所束缚。根据你想在体内或体外进行的治疗方式，你所使用的病毒会面临特定的挑战。”Krell补充说:“在对病人进行治疗之前，每一次操作都有其复杂性，且希望能提前暴露出所有问题。如果你的生产方法正确，你可以选择使用不需要过多操作员干预的封闭式系统。但在体外治疗系统中，暴露和操作更多，也将为污染事件提供更多机会。”
（相关阅读：1. 腺相关病毒（AAV）工业化生产的下游工艺；2. 病毒载体生产：如何满足当前和未来的需求？；3. 解决AAV生产中上游变化给下游纯化带来的挑战；4. AAV载体生产平台选择和产品开发）
在关于细胞和基因治疗病毒污染预防措施的后续问题上，Krell说，“我们需要在使这些治疗可行的同时，确保它们在足够的安全范围内，达到谨慎的平衡。本质上，技术是存在的；我们有办法防止污染。”Wadsworth指出，一个常见的污染源是血清，它可以早在细胞建库步骤中被清除。一次性使用部件也可提供极大的好处。Grebin建议制造商，为了防止污染，需评估他们的整个工艺，而不仅仅是下游步骤。“你们在上游(为防止污染)所做的事情将会改善你们下游的生产过程。在某些情况下，你可能没有一个很好的方法来过滤杂质和污染物，所以你使用的上游平台以及验证完成的好坏，将会影响污染情况。”
第二个演讲人小组由Tom Broughton (Informa Connect)领导，组员包括Nicole Nuñez、Sha Sha (麻省理工学院生物医学创新中心)和Aleš Štrancar (BIA Separations)。向小组成员提出的一个问题涉及生产高滴度病毒载体的最关键步骤。Nuñez说转染是其中最重要的一步，无论是慢病毒还是AAV工艺。她说，生物制造商“必须考虑他们使用的质粒比例、细胞密度、不同类型的培养基以及转染试剂。”我们花了相当多的时间来优化这一步。一旦你确定了一个有效且稳健的转染步骤，这可有助于你的纯化工作，并确保你有相当高的起始产量。”
她补充说，随着优化工艺所需的时间和精力的增加，一个挑战就会出现。“必须调查许多参数，并且必须对每种产品类型重复调查。在学术界，我们试图考虑除了花时间进行经验优化之外，是否有任何其它方法可以有效地应对这些挑战。一种方法是确定这些参数如何机械地相互作用，并影响病毒载体如何在细胞中产生。我们无法完全捕捉细胞中的变量，但我们希望能够验证这些变量的核心。“此外，其它问题还包括监管认可、AAV制造的瓶颈(例如，空衣壳、低产量、高成本和对可放大性的灵活平台的需求)，以及可以优化工艺的技术(特别是这两种：基于微流控技术的微型生物反应器以及在线传感器)。
自动化高通量病毒载体纯化
病毒载体开发和生产
Sam Wadsworth (Ultragenyx)做了题为“Next-Generation Cell Line Development for AAV Gene Therapy Products”（用于AAV基因治疗产品的下一代细胞系开发）的演讲。他突出介绍了他的公司基于HEK293悬浮/质粒转染以及HeLa生产细胞系悬浮/腺病毒辅助平台的基因治疗生产工艺的特点。在与拜耳的合作中，该公司对其HeLa PCL平台进行了工艺优化。具体来说，公司对质粒组分进行了分子改造，对原来的“HeLa1.0”平台进行了多次工艺和筛选改造。改良的“HeLa 2.0”产量可增加10倍，精简了克隆筛选操作。该技术现在被用于该公司开发治疗威尔逊氏病（Wilson’s disease）的基因疗法的工作。Wadsworth演示了如何进一步优化平台(“HeLa 3.0”)来提高AAV载体的产量，以及如何使用siRNA敲除特定基因，来提高AAV的生产滴度。他强调了对威尔逊氏病效力分析的研究，以及使用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白9(Cas 9)在HepG2细胞系中删除ATP7B(在威尔逊氏病中，ATP7B的缺失导致铜毒性)。
Philip Lee (Senti Biosciences)做了题为“Gene-Modified Allogeneic Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Natural Killer (NK) Cells”（基因修饰的异体间充质基质细胞(MSC)和自然杀伤细胞(NK)）的演讲。他介绍了他的公司的“基因回路”平台，这是一种通过结合DNA的方法创建的遗传“逻辑系统”。Lee还讨论了一个案例研究，重点是利用工程MSC，通过慢病毒载体转导，治疗实体瘤。这些细胞来自骨髓，并通过工程处理，表达两种免疫刺激的有效载荷(白细胞介素12和21)。临床前试验数据显示，这些有效载荷的组合是非常有效的，在每个评估的肿瘤模型中都产生了强大的抗肿瘤反应。Lee介绍了他的公司将其基因改造工艺转移至良好生产规范(GMP)规模的策略。他还展示了MSC平台如何扩展到其它基因修饰细胞疗法。第二项研究聚焦于异体自然杀伤细胞治疗癌症的早期阶段开发。Lee介绍了Senti Biosciences的稳健细胞分离和低温保存方法，并突出介绍了该公司在优化其病毒载体工艺和NK细胞转导以及扩增策略方面的持续工作。
Sha Sha发表了题为“Advancing Recombinant Adeno associated Virus (rAAV) Manufacturing By Mechanistic Insights and Modeling”（通过机械理论和建模，促进重组腺相关病毒(rAAV)生产）的演讲。目前，病毒载体工艺行业很难满足AAV生产规模的需求，因为迄今为止，获批的体内基因治疗每剂需要1011至1015个载体基因组(对于全身治疗，剂量更大)。如果这类产品是针对大量患者群体的，生产需求甚至会更大。大多数rAAV的生产方法都会产生缺陷型衣壳。麻省理工学院的一个团队及其合作者正在开发一种基于机械建模和新型过程分析的连续病毒载体生产工艺。目标是为rAAV设计开发一个第一原理数学模型。
“我们希望使用机械模型进行分析，可以帮助我们了解rAAV生产的轨线和瓶颈，这可以帮助我们获得从经验性实验中无法获得的信息，以提高我们的工艺设计能力。”Sha讨论了三质粒转染法，这是最常用、最灵活的转染方法。她介绍了建立机械模型的步骤，并演示了该模型如何捕捉细胞中质粒含量的动态变化。Sha还展示了该模型是如何揭示AAV生产路径上的活动的，以及如何使用这种机械模型来配置AAV生产的连续“流水线”，其中质粒和培养基被连续地注入到工艺中。
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原文：M. Rios, Optimization of Processes and Advanced Platforms for Viral Vector Processing. BioProcess International, 2020.
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