解决AAV生产中上游变化给下游纯化带来的挑战
本文节选自对武田制药（Takeda）奥地利基因治疗中心Orth工厂主管Marian Bendik的采访《Addressing challenges presented for downstream purification by changes upstream》，详细内容，请参考原文。
你能给我们简单介绍一下Orth生产工厂和它的产能吗?
MB：该工厂在奥地利有着悠久的历史。它在临床和商业生产方面有30多年的经验和可靠的记录，从病毒疫苗开始，后来发展到向全球供应的重组蛋白产品。
5年前，我们开始了基因治疗的开发，目的是在生物制品的产品开发中利用这些已被证明的产能。2015年，我们开始了腺相关病毒(AAV)载体驱动的基因治疗产品的GMP生产。
至于我们的核心能力，它们来自用于AAV生产的HEK293细胞系的工艺开发。我们还拥有上、下游工艺开发能力，范围从规模很小的~15mL到200L不等。我们还为临床前研究进行非GMP生产。基于我们在病毒疫苗下游生物工艺方面的技术，我们开发了用于分离完整和空AAV的超速离心方法。
我们还意识到，目前用于AAV生产的制剂缓冲液还无法直接用于商品化产品，所以我们开发了专利的制剂缓冲液，使AAV可以在+5℃下保存几个月而不丧失活性。这个制剂配方也可用于冻干的AAV药物产品，这对于商业化考量来说特别重要。
从GMP的角度来看，我们有一个由200L和500L一次性使用生物反应器组成的GMP AAV平台。我们的下游能力包括完全封闭且自动化的超速离心工作站。我们还有不同的超滤/洗滤和层析系统。对我们来说非常重要的一件事是，我们已经证明了我们AAV制造平台的批次间一致性。
从分析的角度来看，我们有超过50种已建立的方法，其中大多数是内部执行的，这让我们不仅可以加速工艺的开发，还可以加速产品表征和临床放行。
你们现在在做什么？
MB：从产品开发的角度来看，我们正在进行临床前和临床阶段的三个项目，我们还有几个未披露的项目正在研究中。这些内部项目由与外部伙伴的共同开发或制造方案补充。
您目前使用的载体纯化方法和工具是什么?它们的主要优点和局限是什么?
MB：我们的AAV载体纯化从深层过滤开始，它的关键好处是，这是一个一次性使用的系统概念。使用一次性使用系统的负面影响是，当进行较长时间的运行时，你可能会看到所用的过滤器批次差异，这是由于对每个新批次使用了新的过滤器，从而可能导致回收率的差异。
继续往下走，是超滤/洗滤步骤。从我们的角度来看，这样做的主要好处是，这是在生物制品下游浓缩和缓冲液置换的最佳方式，当然在GMP环境下也是如此。从生产的角度来看，不使用一次性使用的系统确实会延长这个步骤的循环时间。另一个限制因素可能是需要在不同的规模上使用不同的系统。
接下来是免疫亲和步骤。这是产物下游纯化生物工艺中最重要的一步，目前市面上的填料能够与不同的AAV血清型结合。如果考虑到局限性，用于不同AAV血清型的商品化填料需使用非常苛刻的洗脱条件。我们必须开发我们的洗脱条件和我们的专用缓冲液，因为我们不想使用可能损害产物生物活性的苛刻条件。
再往下，我们有超速离心步骤，我们认为这是分离完整和空AAV颗粒的最好的方法。一些人认为超速离心法不是一个封闭的系统，但我们使用的是大规模超速离心法，完全自动化，从GMP角度来看，这是一个完全封闭的系统，且可以处理较大的体积。
关于进一步纯化，我们使用离子交换层析，特别是精制步骤。这个步骤的关键好处是它也用于药物的预制剂 - 换句话说，允许AAV长期储存的配方。离子交换层析法的另一个好处是，根据你所使用的具体下游步骤，你可以用“正”或“负”的方式运行它。主要的限制是它不像亲和步骤那样具有选择性。因此，从我们的角度来看，如果可行的话，最好结合离子交换层析和免疫亲和来提高产物的纯度。
如果你可以要求对当前的载体纯化工具箱进行一个特定的改进，会是什么?
我们在工艺规模放大和下游工艺向GMP环境的转变中看到，与基因治疗相比，在其它生物制品领域，人们往往要处理更大的体积。在基因治疗中，中间体和药物底物的体积都显著降低。因此，我认为在层析系统市场上有一个潜在的空缺，例如，它可以在更小的体积和更低的流速下运行，但仍然符合GMP要求。目前，一些系统还没有基因治疗所需的验证范围。
在上游生物工艺发生变化后，您如何寻求解决或控制下游可能出现的挑战?
MB：行业中的标准方法是进行工艺风险评估，并遵循质量源于设计的原则。如果你要改变上游的工艺，每个人都有义务检查并做一个风险评估，以确定这个上游的改变是否会对下游的步骤产生影响。执行此过程风险评估是至关重要的。
其次，是稳健的工艺设计。回到我们前面讨论的例子，这可能意味着应用不同的纯化原理。当你有一个利用AAV表面电荷的离子交换层析法分离步骤时，辅以利用AAV表面表位的、不同分离原理的免疫亲和方法，然后你有超速离心步骤，而其包括基于AAV粒径和分子量的分离，那么你的下游工序非常稳健，能够处理任何来自上游的变化。
我们在生产过程中实施的最后一个要素是过程控制。正确的分析是我们如何监控和控制过程的关键。从下游的角度来看，控制来自上游的总蛋白质是一个重要的因素。下一个非常重要的元素 - 在不同的步骤检测你的产物产量。不仅是载体基因组，还需辅以AAV ELISA，例如，可以显示你是否在损失完整或空的颗粒。对于最终产物的控制，我们已经看到，分析型超速离心分离不仅在控制完整和空AAV颗粒方面有巨大的好处，而且还能有效地鉴定产物不包含带有被截短转基因DNA的不同AAV血清亚型。
原文：Addressing challenges presented for downstream purification by changes upstream，Cell & Gene Therapy Insights 2019; 5(Suppl. 2), 197–201，DOI: 10.18609/cgti.2019.025
相关阅读：