AAV载体生产平台选择和产品开发
本文节选自《AAV Vector Manufacturing Platform Selection and Product Development》，详细内容，请参考原文。
腺相关病毒（AAV）载体被认为是一种非常有前景的基因治疗递送方式。三种此类产品已注册获批 - Glybera（Alipogene tiparvovec，uniQure）、Luxturna（Voretigene neparvovec-ryzl，Spark Therapeutics）和Zolgensma（onasemnogene abeparvovec-xioi，AveXis），且有更多的候选物正在进入晚期开发阶段。在制定AAV基因治疗产品的开发策略时，生物制药厂商应根据其临床1-2期评估以及转换至商品化市场供应的生产策略，从而解决一些基本问题。生产策略包括关键原材料的供应链、细胞-底物生产平台、以及决定将生产外包给CDMO还是自建产能。原文介绍了一些关键选项和变量，及其对AAV基因治疗产品开发的潜在影响。
理想的AAV基因治疗开发时间线
简介：当前的细胞系
基因治疗已经进入了很多人认为的黄金时代，大众的认同来自于多项积极的临床结果，例如2009年报导的Luxturna临床1-2期项目中对于视力恢复的良好效果，以及2012年欧洲对于Glybera药物产品的上市许可，这也是第一个获批的AAV基因治疗产品。这一许可证发布是风投机构进一步投资创新基因治疗公司以及大型制药公司开展更多该领域合作的催化剂。Spark Therapeutics成立于2013年3月，已完成其Luxturna产品的开发，并于2017年12月获批用于双等位基因RPE65突变相关视网膜萎缩症确诊患者。2019年5月，经过5年的临床试验以及对以推荐剂量水平给药的41名患者的随访数据，Zolgensma基因治疗被批准用于两岁以下伴有生存运动神经元1（SMN1）基因双等位突变的脊髓性肌萎缩症患者。鉴于AAV基因治疗可为受影响患者提供的临床疗效和疾病逆转能力，在商品化生产规模下，一致且可重复地生产此类载体成为了产品获批过程的关键考量。有意思的是，三种获批的AAV产品使用了不同的AAV血清型和不同的生产策略或形式。目前，用于AAV基因治疗生产的细胞系主要有两种：人胚胎肾293（HEK293）细胞和分离自草地夜蛾Spodoptera frugiperda (Sf9)的昆虫细胞。
获批的AAV基因治疗生产平台的比较
AAV生产平台选择
AAV生产通常以必要成分的引入开始，如通过瞬时、三质粒转染HEK293细胞或使用两种工程杆状病毒感染昆虫细胞。在两种平台方案中，可针对cGMP工艺建立单细胞系，用于生成任意目的AAV载体。这种方式为确定疾病治疗最佳AAV衣壳血清型提供了很大程度的灵活性。两种平台系统都有一定的优缺点，详细如下所述。
从产品开发和生产运营效率方面考虑，企业应寻找适用于多种产品候选物、且可满足目标适应症载体需求的AAV生产平台和策略。例如，与针对眼病适应症的所需剂量相比，在血友病临床试验中，每个患者使用的平均载体剂量要高出1000多倍。鉴于这些患者的载体需求和系统性给药，以血友病治疗为目标的公司一般会选择使用昆虫细胞/杆状病毒平台。相反，将以局部给药为主的罕见病为治疗目标的公司通常会使用HEK293细胞来满足临床和商品化需求。
选择AAV生产平台时的另一个重要的考量因素是需在相对“激进”的时间线内完成特定的临床阶段，从而确保有额外的资金进入，并维持对外合作关系。许多基因治疗候选物起源于学术机构的“概念验证”性动物数据。此时，需调整生产策略，以降低潜在的监管风险。最近，FDA关于基因治疗的指导文件表明，在进入临床开发时，使用一个成熟、良好表征且可放大的生产工艺和AAV载体，可缩短监管审批的时间。平台选择还有助于决定是否将生产外包给CDMO还是投资建立自身的cGMP生产工厂。后者可更好地控制进入临床开发的时间线。但是，如果初步的临床结果是积极的，但是当前生产工艺不足以支持商业化工艺，那么这种进入临床1-2期研究、评估基因治疗对某种罕见病效果的“快速路径”，可能会减缓获得许可的开发时间线。
哺乳动物HEK293细胞
优点
原始和历史平台
生产简单
无需衣壳序列工程处理
有熟悉使用该平台进行AAV生产的操作人员
合同开发和生产组织（CDMO）和学术机构有使用该平台进行AAV生产的经验
多种载体血清型已有较长的临床历史（经验证的安全性）
已有获批的产品
缺点
相比杆状病毒平台，较低的产量
对于需要较大载体剂量的适应症会有一定的挑战
对于患者群体较大的适应症会有一定的挑战
质粒供应链
时间和运输
重复的cGMP生产成本
安全性
潜在的外源物污染风险
腺病毒或疱疹病毒辅助成分污染风险
针对商品化需求的可放大性顾虑
贴壁细胞培养
规模放大时（贴壁和悬浮）的质粒转染效率
创新趋势
悬浮细胞系的构建
使用3D固定床生物反应器（用于贴壁细胞规模放大）
稳定生产细胞系的构建
演化的新型衣壳，提高组织和细胞特异性
昆虫细胞杆状病毒生产
优点
相比HEK293细胞，更高的产量
安全性
有限的外源物污染风险，避免感染昆虫细胞和人体
无需使用其它辅助病毒（如腺病毒或疱疹病毒）
可放大性
悬浮细胞系
高效的细胞杆状病毒感染
供应链：有可能可构建杆状病毒库，用于大规模发酵
已有获批的产品
需对衣壳序列进行工程处理，以优化衣壳比例
熟悉该平台的操作人员较少
潜在的内源性昆虫病毒序列污染风险
有使用该平台进行AAV生产经验的CDMO较少
含有复制和衣壳基因的细胞系（带所需治疗性目的基因的单个杆状病毒）
构建新的、更安全的细胞系
演化的新型衣壳，提高组织和细胞特异性
生产平台可放大性：开发中的创新和转换
使用贴壁细胞的一个主要挑战是与生产工艺规模放大相关的挑战。依赖于贴壁细胞的方法需要培养瓶数量的"复制"，以获得用于>1x10^16载体基因组（vg）的表面积量。该数值需要使用500多个细胞工厂系统或者100多个CellStack。如此大的数量通常不太适合用于生产，因为受到劳动力、成本以及厂房空间的限制。
上述限制驱使生物制药厂商转向更新的生物工艺设备，如固定床生物反应器（如Univercells的scale-X固定床生物反应器，译者注）或者基于悬浮细胞的生产选项，如用于悬浮驯化HEK293细胞和sf9昆虫细胞平台，以及稳定生产细胞系。稳定生产细胞系的使用与生产单克隆抗体的形式相似，此类工艺可相对简单地放大至2000L或更大的规模。这种方法相对较新，可能可与昆虫/杆状病毒生产系统竞争，以用于需要更高载体数量的适应症。
目前，最小的转变是贴壁细胞的二维培养向三维培养的转变，进而转变为悬浮HEK293细胞，以及从HEK293细胞转变为昆虫细胞。在所有的转变过程中，都需使用一系列的分析检测，对所生产的产品进行关键产品质量属性的评估，必要时，需进行体内动物模型或临床比较。
两个从贴壁HEK293转变成sf9生产平台的典型案例是UniQure的Glybera，以及Voyager Therapeutics转变了其Parkinson病项目。在两个案例中，转变发生在临床开发的1-2期至2-3期。
灵活策略将是关键
在决定用于AAV基因治疗产品开发的生产策略时，需要考虑多个变量，包括计算临床和商业化载体需求、公司开发策略、对生产选项的熟悉程度和专业度、以及达成临床开发里程碑的时间线。在开发中转变生物生产策略的能力是一种已获共识的现实，所以随着基因治疗领域的成熟，以及对患者群体的需求的适应，使用灵活且可调整的方法进行载体生产将越来越重要。
原文：J.Rininger, A.Fennell, L.Schoukroun-Barnes, et al., AAV Vector Manufacturing Platform Selection and Product Development. BioProcess International, 2019, 11: 22-24.
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