基于病毒载体的基因治疗：通过可放大、可再现的生产工艺实现其潜力
本文节选自《Viral Vectored Gene Therapies: Harnessing Their Potential Through Scalable, Reproducible Manufacturing Processes》，内容有删减。由于水平有限，不当之处，还望谅解和指正。文章仅代表原文作者观点。详细内容，请参考原文。
我们可能不会把爵士乐女王埃拉·菲茨杰拉德（Ella Fitzgerald）和21世纪的基因治疗联系起来，但其在1939年演唱“T'ain'T What You Do （It's the Way That You Do It）（这是你做事的方式）时，就预示了什么。尽管在严格的临床试验中，证明基于基因的疗法的安全性和有效性，对于获得监管机构的产品审批至关重要，但仅仅满足最低标准是不够的。这类产品的生产方式也很重要。可确保基于基因的疗法的安全性、纯度和一致性的生产工艺和方案，对审批过程至关重要，而高经济性的生产工艺对商业成功也同样重要。
美国食品和药物管理局（FDA）批准了用于治疗RPE65 突变相关视网膜营养不良的Luxturna（voretigenene parvovec-rzyl）以及用于治疗SMN1相关脊髓性肌肉萎缩症的Zolgensma （onasemnogene abeparvovec-xioi），证明了基于腺相关病毒（AAV）的基因疗法作为变革性疗法、以治疗未被满足的疾病治疗需求的潜力。针对不同适应症（包括脉络膜血症、B型血友病、IIIA型粘多糖病、X连锁性色素性视网膜炎（XLRP）和色盲）的晚期基因治疗临床试验正在不断增加，预计在未来几年将有更多产品获批。
生产挑战
尽管已证实AAV载体基因疗法是一种可用于多种疾病适应症的有效治疗方式，但目前的生产方式仍对扩大基于AAV的产品的发展构成了不小挑战。这主要在于产生重组AAV载体的复杂性，其需要同时引入多个DNA序列，包括编码AAV复制（rep）和衣壳（cap）的基因、治疗性目的基因、以及对于AAV复制进入细胞所必需的辅助功能基因。接收了rep、cap和辅助功能基因、但缺乏治疗性基因的细胞会产生缺乏治疗潜力的空载体。
比较(A)三质粒转染和(B)疱疹辅助载体扩增(HAVE)生产重组腺相关病毒(AAV)载体；在三质粒转染过程中，目的转基因、编码AAV复制(rep)和衣壳(cap)蛋白的基因以及编码腺病毒辅助功能(E2A、E4和VARNA)的基因被分离到单独的质粒上，并转染到腺病毒E1表达细胞系中。由于不是所有的细胞都可接收这三个质粒，所以会导致出现空的、部分和完整AAV载体混合。在HAVE方法中，将携带rep和cap序列和一个目的基因(GoI)的重组单纯疱疹病毒(HSV)载体引入悬浮培养的鼠肾(BHK)细胞中。这可使整个群落中完整AAV载体的比例更高。
一些AAV生产工艺使用贴壁细胞，其必须在培养瓶或组织培养板表面培养。这种工艺的天然限制是，其可规模扩展（通过增加表面积），但不能规模放大（通过增加体积）。这意味着只能通过增加培养容器的数量来增加产量，如堆叠细胞工厂或滚瓶，这将显著增加对物理空间的要求，同时提高了生产成本。此外，管理和处理数量众多的培养容器需要更多的操作员，增加了污染和处理错误的风险。
规模扩展与规模放大的比较：A）采用细胞工厂和滚瓶的生产方法规模扩展需要相当数量的容器，增加了操作和占地要求；B）使用基于生物反应器的生产方法可通过提高反应器尺寸来进行规模放大，这将大大减少占地、操作和劳动力需求。
迫切的需求
尽管有这样的限制，许多实验室和工业AAV生产工艺仍然依赖于贴壁细胞的瞬时转染。虽然贴壁工艺可能可支持临床前和早期临床开发，但其稳健性通常不足以满足晚期临床或商业生产的需求。这是因为它们在单位体积培养中生产的活性载体的比例很低，而高单位体积产量是开发一个经济、有效的AAV生产工艺的必要条件，以满足晚期临床和商业化需求。这样的工艺也可以减少试剂的体积，这反过来可以降低试剂的成本和相关设备的尺寸。从成本角度看，可放大性对于满足罕见病和低剂量适应症的需求非常重要，同时，从可行性角度看，在大多数常见适应症方面也有明显的优势。
鉴于贴壁细胞生产工艺的局限性，行业急需其它替代性方法。基于杆状病毒和腺病毒的方法依赖于悬浮培养的细胞，使实现可放大的生产工艺，其使用通常在GMP条件下用于生产重组蛋白和抗体的生物反应器。然而，这些方法也有其局限性。使用杆状病毒表达载体系统（BEVS）在昆虫细胞中生产哺乳动物病毒载体有一定的挑战，比如，AAV载体的感染性较低。稳定转染的生产细胞系可通过腺病毒感染生产AAV，支持高效、大规模生产AAV，然而，每种新的基因治疗需要一个独特的生产细胞系，降低了方法的整体效率。
载体扩增解决方案
疱疹辅助载体扩增（HAVE）为AAV载体的生产提供了一种稳健、可放大且高效的方法。AAV的单纯性疱疹病毒（HSV）载体生产通过使用哺乳动物细胞，克服了基于杆状病毒系统的局限性，而且，HSV载体消除了使用基于腺病毒的系统时，所需的多种生产细胞系的开发。
在HAVE方法中，悬浮培养的仓鼠肾（BHK）细胞共感染两种重组HSV载体：一种携带AAV rep和cap基因，另一种载体携带与AAV倒末端重复序列侧面相接的目的治疗性基因。这种方法可以对cap基因序列进行定制选择，以获得最佳的细胞靶向和转导。HAVE系统可使用即用方式结合用于多种AAV血清型，包括AAV2衣壳的专利异构体，后者的三个酪氨酸残基被改变为苯丙氨酸，以增强视网膜细胞转导。与相同重组序列的瞬时转染相比，HAVE方法可使产量提高50倍。通过“激进的”规模放大，HAVE还有望将商品成本（CoG）降低90倍。这种降低可通过HAVE工艺的多个方面实现，包括：
利用生物反应器实现生产规模放大的能力，而不是通过增加容器进行规模扩展
提高了上游产能和下游收率，减少了空载体的比例
单个HAVE生产批次可满足早期临床试验的需求，进一步证实了这种生产方法的优势。
与其它AAV生产方法相比，HAVE工艺在临床和法规方面具有多种优势。首先，其已证明了在早期临床开发中化学、制造和控制（CMC）的成功。系统适应性已经为六种成功的研究型新药（IND）申请提供了物料，没有任何临床的滞缓。HAVE辅助结构载体具有较强的稳定性。研究人员已经能够开发和并向合同研究机构（CRO）合作伙伴转移针对产品的分析方法。整个HAVE工艺已经成功地转移到行业伙伴和合同生产组织（CMO）。
其次，用于生产重组HSV载体的BHK细胞和基于VERO的细胞在生产治疗性蛋白和疫苗方面的应用已得到验证。FDA和其它国家监管机构也对HAVE工艺进行了审查。
不仅仅是怎么用，也要考虑何时用
尽管爵士女王强调“你做事的方式”是正确的，但AAV生产的“时间”对临床、监管和商业成功也是至关重要的。许多有前景的基因治疗项目源自于科研实验室使用的小规模、低产率的AVV载体生产方法。这些方法可能适用于学术机构，并可为临床前动物研究提供物料，但它们往往会给今后的发展道路带来不小的挑战。
为此类项目申请许可的生物制药公司通常会受到更快进入人体临床试验早期阶段的压力。因此，在获得能够证明长期临床成功和商业可行性的II期临床数据之前，他们通常不愿投资于高生产率的生产工艺和设备。从资源使用的角度来看，这种不情愿似乎是有道理的，但从长远来看，它可能会造成产能与临床及监管需求之间的鸿沟。在临床开发后期改变生产工艺，即使这种改变有利于提高产量，也会导致启动或完成关键试验的重大延迟，除非这种改变在物料需求之前能很好地实施。发展稳健的表征分析，对于引导进行成功的生产工艺变更是必需的，因为其结果必须证明最终产品是相当的，即使用于生产它们的工艺有差别。
AGTC在其临床产品线开发的早期就投资于其HAVE平台，将生产效率和质量视为基础的起步要求，而不是未来的需求。这一战略消除了公司的不同管线在进入临床开发时的载体生产及检测的壁垒。它还使产能的发展超越了遗传性视网膜疾病的需要，从而可支持不同载体要求的、更为宽泛适应症种类。
随着生物制药行业致力于使基于AAV的基因疗法成为一种“现成”的方法，以解决越来越多适应症未被满足的临床需求，生产变得越来越重要。如果想要获得长期的成功，可放大、高产量的方法，比如在开发早期采用HAVE方法，就是“做事情的方式”。
原文：S.Washer, D.R.Knop, Viral-Vectored Gene Therapies: Harnessing Their Potential Through Scalable, Reproducible Manufacturing Processes. BioProcess International, 2020, 18(6): 46 - 50.
扩展阅读：
用于基因治疗生产的“即用技术”工艺