如何利用连续逆流切向层析推进连续生物工艺
本文节选自《How to Advance Continuous Bioprocessing using Continuous Countercurrent Tangential Chromatography》，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
最近的多篇论文研究了连续生物生产的潜在好处，包括降低商品成本，开发多产品工厂的更大灵活性，以及通过更短和更均一的滞留时间而提高产品质量。例如，Walther等人得出的结论是，相对于单克隆抗体 (mAb) 生产的传统批次操作，整合式连续生物生产平台可以使工艺成本 (净现值) 降低55%，估计用于其它重组蛋白产品时，成本降低幅度将更高。连续生物反应器已被证明可比相应的补料分批系统提供更高的生产率，且具有更好的产品质量，并可减少批内异质性。
尽管连续灌流生物反应器已经在商业化生物生产中使用了超过25年，但连续下游工艺的实施是非常有限的，关键的挑战之一是在最初的捕获步骤中使用结合-洗脱层析，例如Protein A亲和层析捕获mAb。结合-洗脱层析本质上是一种批次工艺：在填料完全负载结合产物之前，不能开始层析柱漂洗；在漂洗完成之前，不能开始洗脱；在产品回收完成之前，不能开始淋洗和再生。行业已经开发了一些多柱层析工艺，可以提供连续的产品上样，但是这些系统会随着洗脱产物液流的浓度和pH/电导率周期性变化而循环运行。这不仅使这些系统与后续的下游单元操作的整合变得复杂，而且还为完全整合的连续生产工艺的长期操作所需的适当过程控制策略的开发带来了挑战。
图1：连续逆流切向层析 (CCTC) 用于从结合单克隆抗体 (Y形) 中去除杂质 (椭圆形) 的原理图。
连续逆流切向层析
连续逆流切向层析 (CCTC) 通过在流动的浆液上进行层析操作 (结合、漂洗、洗脱、淋洗和再生)，解决了基于柱的系统的固有局限性，其带有在线静态混合器，用于确保填料浆液与澄清的细胞培养液/所需缓冲液之间的良好接触。然后使用中空纤维膜组件进行液流-填料的分离，例如，从填料结合的产物中漂洗掉载体，如宿主细胞蛋白，前者被膜完全截留 (图1)。CCTC的独特特点之一是静态混合器 – 膜的组合，其以逆流配置排列，以使产品纯化程度和产量最大化，并降低工艺所需的缓冲液用量。这种类型的逆流分级方式已在化学制造中广泛使用，例如在蒸馏、吸附和提取中，但尚未被开发用于生物工艺。此外，与填充柱层析相比，流动浆液的使用显著降低了CCTC工艺的压力要求 (最大压力<15 psi)。最终结果是，CCTC中的整个工艺是完全一次性的，极大地促进了CCTC在一次性使用生物工艺设施中的可利用性，以生产多种产品，实现快速设置/转换。
与多柱系统相比，CCTC是一种真正的稳态工艺，随着填料连续流动通过进行不同层析操作的静态混合器-膜组件(图2)。CCTC完全消除了多柱和模拟移动床层析系统所特有的复杂阀门切换操作；CCTC的整个流路在稳态下运行，没有任何流量或连接变化。这种稳态操作不仅有利于过程控制和整合，还意味着CCTC中的所有填料都在使用，从而相对于柱色谱，生产率大幅提高。此外，CCTC中的压力降与填料粒径无关，允许使用小粒径填料，其通常具有更快的结合动力学和更大的结合载量。使用20- 25 μm粒径的Protein A填料获得的最新数据显示，其产率为140g抗体/L填料/小时，是传统填充柱的10倍。在CCTC中，洗脱产物以低于柱层析的浓度回收，因为流动的浆液中最大填料浓度约为15%(按体积计算)，但这很容易通过在洗脱步骤中集成单通过切向流动过滤(SPTFF)模块来调节。SPTFF不仅可以提高后续单元操作的效率，还可以通过提供调整产品浓度的机会，以响应灌流生物反应器操作中的上游干扰，从而促进适当控制策略的开发。
图2：在CCTC系统中填料(绿线)和缓冲液的流动路径。
全整合式CTCC工艺
虽然由于Protein A层析步骤的成本非常高，CCTC的大部分早期工作都集中在初始产品捕获上，但CCTC也可以用于以结合-洗脱或流穿模式进行精纯操作。最近的研究已经证明了一个完整的连续下游工艺，其使用Protein A、阴离子交换和阳离子交换CCTC步骤纯化单克隆抗体。这个三步工艺能够将宿主细胞蛋白 (HCP) 浓度从690,000 ng/mg降低到10 ng/mg以下 (低于定量限)。最终产品含有超过99%的单体，与基于传统柱层析的工艺相比，在大多数情况下更好。CCTC也可以直接与使用合适细胞截留装置的灌流生物反应器相整合，澄清的细胞培养液上样至基于Protein A的CCTC捕获步骤。成本预测表明，采用这种全整合式CCTC技术的工厂每年可以产生600公斤的单克隆抗体，生产成本低于$40/g，且仅需要5,000平方英尺的占地面积。
前进的道路
2011年，时任FDA药物评估和研究中心主任的Janet Woodcock博士在AAPS年会上明确指出了其支持从批次到连续工艺的过渡。Woodcock预测，“在未来25年，行业将发生变化，当前的生产实践将被抛弃，取而代之的是更清洁、灵活、高效的连续生产” Amgen首席执行官Robert Bradway指出:“目前用于在细菌或动物细胞中生产药物，然后分离它们的系统非常昂贵，且可能需要数月时间。有了更高效的工艺，制药公司可以迅速增加高需求药物的产量，它们也可以更经济地生产治疗罕见疾病的药物。”
虽然连续操作最近已经被引入到几种小分子的生产工艺当中，但采用完全连续的生物生产在很大程度上仍然是一个理论概念。造成这种情况的主要原因在于与连续的下游工艺相关的挑战，特别是用于初始产品捕获的适当连续技术的开发。连续逆流切向层析法有许多独特之处，可以解决这些挑战，使低成本、高灵活性的单克隆抗体以及用于新型基因治疗的病毒载体的连续生产得以发展。结合用于过程监测和控制的过程分析技术(PAT)的不断进步，在不久的将来，连续生物生产的愿景可能最终会实现。
原文：A.Zydney, How to Advance Continuous Bioprocessing using Continuous Countercurrent Tangential Chromatography. Bioprocess Online, 2021.
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