理解灌流术语
本文节选自《Understanding Perfusion Terminology》。由于水平有限，详细内容，请参考原文。
简介
在过去的几年里，灌流已经成为生物制药工业发展中一个越来越有吸引力的工艺。它被视为一个提高整体生产力的机会，而且与补料分批培养不同，灌流可以集成到连续的生物工艺工作流程当中，以实现持续的产物生产和纯化。此外，灌流工艺可以延长运行时间，提高生产率。为了充分评估灌流应用在生产过程中是否有效，关键是要有标准化的术语。本文将解释理解这一工艺所必需的关键术语。
每日罐体积：灌流培养中的培养基置换率
基于灌流的细胞培养在操作和术语上与补料分批培养有一些关键的不同。例如，在补料分批培养中，每隔一段时间就提供浓缩补液，以将营养物质补充到固定的生物反应器中。当生产力停止后，开始收获批次。在灌流工艺中，细胞被截留在生物反应器内，并以相同的速度不断地置换培养基 -新鲜培养基提供给细胞，同时去除耗竭的废培养基 (细胞废物和因细胞代谢而耗尽营养物质的培养基)。这种置换表示为培养基置换的每日罐体积 (VVD)。例如，每天向一个工作体积为2 L的系统中灌注2 L的培养基将被表示为1 VVD (图1)。降低VVD将直接减少系统处理的新鲜和耗尽的培养基的量，并可能减少细胞截留装置的负担。然而，更高的VVD可以获得更高的持续活细胞密度(VCD)、生产力以及更快的产物去除，这有助于进一步提高产物质量。最常见的培养基置换率在2到3 VVD之间。
图1. 以1 VVD进行灌流培养的例子。使用Gibco™ High-Intensity Perfusion (HIP) CHO培养基进行连续灌流。在第19天，调整操作，以更好地利用培养基，这形成了一种新的稳定状态，目标为更低的细胞活性百分比。新的目标在第29天左右达到。
虽然VVD通常被用来描述总的培养基置换率，但有些文章在描述VVD时可能只考虑了耗竭的培养基（Spent Medium）流速。额外的培养基可能通过取样、细胞废弃（Cell Bleeding）或其它操作而被去除。如果报告的值仅指耗竭的培养基，它将低于实际置换的培养基总量 (图2)，这可能使报告的VVD极具误导性。
图2. 灌流流速的简单示意图。通常，VVD是指总体培养基置换率。本例中的VVD为1.2 VVD。有时候，报告的VVD可能只包含耗竭培养基，这可能会产生误导。如果使用细胞废弃，耗竭培养基的流速将低于实际置换的培养基总量。
细胞废弃：从生物反应器去除细胞
细胞废弃是连续灌流的一个重要组成部分。在连续灌流和某些强化补料分批灌流中，细胞生物质被从反应器中移除，以维持所需的细胞健康性和培养环境。废弃的起点通常确定为突然改变的生长率，即活细胞密度 (VCD)增加 (图3)。废弃通常以流速或废弃百分比进行描述，即VVD培养基流速中以废弃去除而不以耗竭培养基去除的百分比。在图2中，废弃为16.7% (0.2 ÷ 1.2)。理想情况下，应尽量减少废弃，以最大限度地提高工艺效率。废弃率有时也称为细胞丢弃率(cell discard rate，CDR)。
图3. 一个连续灌流应用中的废弃率 (废弃百分比)、VCD和活性百分比。开始阶段废弃提高，以防止细胞密度过高，然后调整速率，以维持目标细胞活性为95%。这获得了大约95 x10^6 cells/mL的稳态。
细胞截留效率：保持在生物反应器内的细胞百分比
“固有废弃”是在灌流应用过程中，因耗竭培养基而损失的细胞百分比；当使用基于沉降的细胞截留方法时，经常用“%效率”来代替，这是指细胞在反应器中截留的百分比，即循环回到生物反应器的细胞与在耗竭培养基中被去除的细胞的百分比。相较而言，基于过滤器的方法，如交替式切向流过滤(ATF)和切向流过滤(TFF)在耗竭培养基中没有细胞损失，被认为是100%效率。
如果计划在规模缩小模型和规模放大工艺中使用两种不同的细胞截留方法，那么在解读数据时必须仔细考虑。例如，使用离心方法进行强化补料分批灌流，其效率为90%，即产生了10%的“自然”废弃。这将导致VCD上升速度较慢，VCD峰值较低。此外，与使用基于过滤器的方法重复的相同运行相比，它将有更长的峰和更慢的下降。
图4. 在使用Ambr 15细胞培养生物反应器进行的规模缩小灌流模型中，取样和离心导致的细胞损失。图中所示为总共12种条件的大约废弃百分比。
在图4中，显示了在以Ambr™15细胞培养生物反应器(Sartorius)运行的规模缩小灌流模型中，12种条件下的大约废弃百分比。废弃是由于每天培养取样所导致的3%直接细胞损失以及离心过程中耗竭培养基的去除而造成的。这些条件的平均水平通常在6.5%左右，由于这是一个手动工艺，每天的变化幅度很大。通过跟踪耗竭培养基中意外的细胞损失以及直接废弃细胞，可使每日废弃更加均匀，使细胞总废弃始终保持在~10%。如果对工艺有益的话，细胞废弃可以更高。由于细胞的持续生长，规模缩小模型中10%的废弃并不等同于更大规模下10%的连续废弃。在规模放大工艺中，10%的直接细胞损失比10%的连续细胞损失的影响更大。
图5. 记录两个使用恒定VVD培养基置换速率的灌流重复运行的日生长速率。生长速率的突然下降可以通过比较出现生长速率下降的两次运行的VCD来估计细胞系和培养基的CSPR。V2:罐2，V3:罐3。
CSPR考量
特定的克隆 - 一个生长到17 μm且产量为30 pg/day的克隆比一个生长到12 μm且产量为17 pg/day的克隆需要更多的培养基。不同的克隆会有不同的CSPR。
CSPR不是线性的 - 细胞生长速率和行为会随着细胞密度的增加而变化。在初步评估中，CSPR的评估应尽可能接近最终的预期目标运行条件。
最低CSPR助于保持细胞处于对数生长阶段 - 相对于给定细胞运行的可接受参数，这种生长可能是过度的。
培养基配方和细胞克隆的营养需求是不同的 - 这些需求取决于工艺如何运行，因为不同的代谢途径将被增强或降低。在两种不同的培养基配方条件下，相对于培养基置换率，不同的细胞密度下，细胞克隆的行为可能不同。
初步的CSPR评估应该作为特定克隆和培养基匹配的工艺开发指南。最终，实际的稳态CSPR可能不同于初始的理想最低CSPR。对于一个优化的工艺来说，不同的培养基配方可能导致不同的理想最低CSPR和不同的最终操作稳态CSPR。
VCD和活性百分比：连续灌流中可操作的控制目标
VCD和活性百分比是灌流和补料分批培养中广泛使用的术语；但是，作为管理、优化和自动化一个连续灌流培养的控制目标时，会有不同的特性。在连续灌流中，可通过细胞废弃调节活性百分比和VCD，以维持细胞培养健康：
VCD可维持得足够低，以避免过量的营养物损失或废弃物积聚，从而防止生产力降低，细胞死亡率的激增可能导致培养无法恢复 培养可维持在特定的活性百分比，以获得一致的质量目标
在稳态条件下，VCD恒定，生长速率通过死亡率和因废弃而产生的细胞去除率得以平衡（图6）。如果废弃提高，VCD将降低，生长速率将提高，直到达到新的稳态。在更高的生长速率、但相同或更低的死亡率条件下，将形成更高的活性百分比。如果废弃降低，VCD将提高，生长速率将降低。如果死亡率不改变，将导致更低的活性百分比。这种情况将持续直到达到临界点，即生长率低于废弃加死亡率，致使VCD和活性百分比下降。为了限制细胞废弃，但仍保持较高的VCD和活性百分比，细胞死亡率需要随着VCD的升高而降低。
图6. VCD、总细胞密度和废弃率之间的关系
在灌流工艺中，为进行工艺控制，通常关注VCD。在对数生长阶段，结合CSPR，VCD可用于自动调节VVD培养基置换速率，以使培养基的利用率最大化。这也可以降低细胞暴露于过量的高营养物质，更容易地过渡到稳态。评估最高VCD和预期的所需VVD，有助于计划对所需设备的初步评估，也有助于对初步计划的操作目标的评估。对于稳态的维持通常可转化为对于细胞废弃的调节，以维持确定的VCD控制目标。但是，这通常会导致较差优化的工艺。看下细胞废弃是如何作用于工艺的，如果VCD目标设定得过低，废弃将比所需的更高，导致营养物质被过度浪费，使工艺在比所需更高的活性百分比条件下进行操作。如果VCD目标设定得过高，废弃将很低，会导致营养物质被过度剥夺的风险。这将使活性百分比过低或导致培养“崩溃”风险。
相比之下，如果我们定义一个与产品质量需求相匹配的目标稳态活性百分比，调整细胞废弃以主动“驱动”和维持活性百分比的过程将自动推动工艺稳态，以保持目标质量趋势，同时更有效地利用培养基。VCD将平衡到任何可以合理维持的属性，同时使目标质量特性维持在特定克隆和培养基在给定VVD培养基置换速率下的所需值。该方法有利于快速工艺优化。它还可以在评价一个灌流工艺的不同培养基和操作试验条件时，提供一个公平的比较。结果对于规模放大来说将更有意义，以帮助确保一致的质量趋势。
活细胞体积：与VCD更出色的替代参数
VCD是一个可提供目标操作、实现自动化和帮助评估工艺性能和行为的参数。但是，在灌流运行中，细胞尺寸会发生显著的变化。这会影响营养物质需求、生产力以及代谢行为，继而影响细胞培养操作。对于将VCD作为控制策略一部分的灌流培养操作，特别需要注意细胞尺寸。活细胞体积（Viable cell volume，VCV）可按以下公式计算，即活细胞密度乘以活细胞的平均体积。VCV是替代VCD使用的一个出色参数，单位为mm3/mL。
细胞直径从12 μm小幅增加至13 μm，会使细胞体积提高27%。在较小的细胞尺寸条件下评估的理想最低CSPR可能会导致不充足的培养基置换速率。当试图确定细胞培养稳态时，VCD可能看起来是稳定的，即一致的细胞分裂速率 vs. 死亡率，但细胞直径可能会增加。如果细胞尺寸的增加没有被考虑，有可能会误认为培养已处在稳态。在现实中，培养基必须支持的总细胞质在增加，由于总细胞质需求超过了提供的营养物质，最终可能会导致活性百分比的下降。使用VCV替代VCD，可以达到与细胞培养行为更好的相关性，实现更加一致的控制和自动化。
当考虑细胞特异性产率（Qp，单细胞产量）时，通常以每个活细胞每天生产的pg产物表示，相比VCD，使用VCV会更加合适，因为与活细胞计数相比，生产力通常会随着总活细胞质而更好地增加。对于使用VCV的特异性产率单位，可以简单地表示为每cm3 VCV每天mg产物。
总结
理解本文讨论的参数对于理解灌流至关重要。如果没有清楚地理解这些术语，生物制药行业可能会错过建立良好灌流工艺的机会，而后者可提高整体的产量，并建立连续的生物工艺工作流。
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原文：Understanding Perfusion Terminology. BioProcess Online, 2021.https://www.bioprocessonline.com/doc/understanding-perfusion-terminology-0001.
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