灌流培养基和上游工艺的经济性分析
本文节选自《Economics of Perfusion Culture Media and Upstream Processing》详细内容，请参考原文。
细胞培养基及其开发已成为影响灌流生物工艺性能和促进灌流生物工艺采用的最重要参数之一。用于灌流的培养基可以不同地使用，通常是相比批次工艺，更高的浓度。培养基在化学和物理上也可能不同。
由于最近对灌流的兴趣增加，我们准备了一份经济性分析来评估与培养基相关的成本的影响，以比较灌流和批次工艺。我们估测了在一次性使用生物工艺系统中，灌流式培养基与相当的批次工艺的相对成本。通过与生物工艺决策者和管理者的访谈，我们确定了成本因素，然后定义了典型数据和变量范围，以区分灌流工艺与相当的批次工艺，并重点关注了细胞培养基相关的成本。
对灌流技术的兴趣越来越高
根据BioPlan的第17届年度报告和生物制药生产能力和产量调查(https://www.bioplanassociates.com/17th/)，对探索灌流技术在生物制造中的应用非常感兴趣的受访者比例有所增加。今年，我们询问了受访者哪些新的生物工艺系统/创新将在工厂中进行评估或测试，超过44%的受访者表示，“上游连续工艺/灌流”系统将是明年评估或测试的主要系统。
尽管灌流式生物反应器已经在生物药的生产中“商业化”应用几十年了，但最近这些技术的复兴是由于各种各样的原因。Thermo Fisher研发工程科学家Christopher Brau提供了供应商角度的观点:“这是管理不同投资组合、解决下游瓶颈以及提高效率(如自动化和连续工艺)的需要的结合。”
进行经济性评估
我们对影响灌流与批次决策过程的经济因素的评估基于2020年8月对终端用户和关键问题专家的经济性访谈。我们试图捕捉定义使用经济性的因素。然后，我们创建了一个经济分析模型，来支持关于灌流与批次工艺的讨论，包括预测与培养基相关的成本和上游总成本。灌流和相当的批次上游工艺的成本是高度可变的，定义适用于多种设施、规模和应用的明确参数非常困难。
所建立的模型不考虑与细胞培养基潜在相关的“间接”成本。这些成本可能相差很大，根据工厂/公司的不同，可以分配不同的成本。事实上，许多分析都没有包括“间接的”非生物加工针对性成本。然而，其它公司却将各种间接成本作为其成本分析的一部分。间接成本可以包括那些与一般员工、设施、公司间接费用和支持费用相关的费用，一般公用设施、暖通空调、QC/QA、监管支持、IT支持、空间/房产成本、维护、管理监督等。在经济学模型中，间接成本被认为是与培养基相关的总直接成本的一个百分比，就像间接费用被计算出来一样。因为这些成本在灌流或批次工艺中是相等的，所以我们排除了这些。
我们之所以关注对灌流进行比较分析，是因为灌流技术的使用者对耗材，特别是培养基的成本，表达了越来越多的担忧和困惑。
决策者在考虑批次和灌流平台，以评估耗材成本时，需要仔细地看“更大的画面”，而不仅仅是每克产品的培养基成本，因为这样评估的话，灌流与补料分批相比，培养基成本更高。
然而，Brau认为，每克产品总成本降低的潜力和更低的资本支出可以极大地促进许多新工艺案例采用灌流。Brau指出，“即使是在目前的大规模不锈钢补料分批生产的混合方法中，也有在种子扩增中进行N-1灌流的实际案例。“虽然不是所有的细胞克隆都适合连续生产，但从培养基消耗的角度来看，许多生产工艺都能受益。"
通过灌流来解决批次工艺的挑战
灌流可以解决毒性和不稳定产品的问题，因为不断的产物去除而获得了更好的系统。同样，下游瓶颈也减少了，因为系统可以设计为更稳定、更小的工艺，而不是必须一次性处理单一的、大规模的蛋白质收获液。不太明显的挑战也得到了解决，比如允许使用更灵活的封闭系统。灌流允许生产反应器缩小到更多的一次性使用规模(例如，1000L以下)。这给了生产车间更多的灵活性。一些操作需要单层的工作空间；此外，生产相对大量产品所需的规模更小，可能允许更容易地进行临床物料生产，且前期投资更少。随着行业走向自动化，稳态工艺通常比补料分批运行更容易实现自动化。这也可以降低潜在的劳动力成本，降低人为因素风险。
不同，从培养基消耗的角度来看，灌流平台可能需要对工艺中所需的更大体积的培养基的物流进行规划。Brau指出，“估计培养基置换速率，以支持你的细胞，这一过程意味着你一开始将以一种更浪费的方式运行，直到你缩小实际的工艺限制范围。“灌流的其它挑战包括，一旦选择性压力被移除，细胞系的生产稳定性相对较差，或者细胞系不够稳健，需要大量的废弃(大量细胞和产物去除)来维持可接受的目标细胞%活性。Brau说:“这两种情况都可能’侵蚀’你的成本效益。”
灌注的采用并不完全是成本驱动的
这些直接节省的成本往往不是采用灌流方法的主要原因。除了一些较敏感的API/蛋白质需要更温和的灌流生物工艺外，灌流还提供了一些较难量化的成本节约。这主要与更小的生物反应器和工艺线有关。灌流允许采用基于一次性使用的生产模式，例如，重复循环500 L灌流的一次性使用生物反应器可与重复使用≥4倍更大的批次生物反应器相当，而超过2000L的生物反应器几乎都是不锈钢的。
因此，灌流能够实现使用一次性使用系统的商业规模生产(超过2,000 L批次生物反应器的限制)，现在许多终端用户、工厂和公司都倾向于使用一次性使用系统，而不是不锈钢。此外，从工艺线和工厂空间、洁净室大小、公用设施、管道，特别是前期和长期资本支出方面考虑，灌流工艺的成本通常比类似的批次工艺要低得多。更低的处理强化和较小的灌流规模也可以减少生物工艺人员要求。如前所述，与批次工艺相比，灌流工艺也被认为是自动化和相关成本节约的更好选择。
在灌流工艺中生产产品的一个特别优势是获得高或更高质量的蛋白质。不断去除细胞培养中的有毒废物和耗竭的培养基，并补充新鲜培养基，显著提高了最终产品的质量。例如，带有被改变的结构的蛋白质较少。
灌流的成本
单从培养基考虑，在灌流中，每克药物底物/API的灌流培养基的成本通常比“可比的”批次工艺高20-30%，因为每克药品生产使用更多的培养基，灌流培养基也通常比批次更浓缩。
目前使用的灌流系统很少超过500 L，这也是目前一次性使用灌流系统的有效上限。很少有设施的规模在500 L以上，如因子VIII的大规模生产和用于其它条件敏感性血友病因子的生物反应器，灌流在其商业化生产中的应用已有相当长的时间了。
灌流工艺的主要成本是与培养基有关的费用。这包括培养基成本、WFI和人工成本。通常在可比的水平上，批次工艺的主要成本是一次性使用设备和其它耗材的成本。
在生产率方面看，即每克成本，灌流的成本通常比“可比的”批次工艺(生产相同产量的时间，例如每年)更高。例如，据估计，250L的典型灌流工艺的上游总成本约为50美元/克，而可比的批次工艺的上游总成本约为38美元/克，或低24%。
细胞培养与蛋白质
根据细胞系特性和所生产的蛋白质，可以从稳定运行一段时间的灌流工艺中获得更高量的蛋白质(相对于“可比的”、在一段时间内，如每年，生产相同量的蛋白质的批次工艺而言)。在灌流工艺中，细胞密度可达到80 – 120 x10^6 cells/mL，而在典型的批次工艺中，细胞密度可达到20 – 30 x10^6 cells/mL。每次工艺运行可生产更多的活性药物，但灌流工艺比批次工艺的运行时间要长得多(也使用更多的培养基)。
在典型的灌流工艺中，随着时间的推移，需要许多体积值的细胞培养基通过灌流反应器，以达到恒定的细胞稳态，从而获得高单位体积产量和最佳质量的蛋白质产物。对于一个成功的稳态灌流工艺，需要确定理想的细胞系特异性灌流速率(CSPR)或灌流速率(每日罐体积，VVD)以及废弃率，即细胞从工艺液流去除的速率。
能够承受灌流工艺长时间运行的最佳稳定细胞系是灌流工艺的重要组成部分。灌流细胞系的生长速率应使废弃率和CSPR不负面影响该工艺的经济可行性。因此，当细胞密度足够高以达到高产量，且细胞仍处于一种由营养限制或其它环境因素控制的生长状态，而可尽量减少废弃率时，该灌流工艺被认为是最佳的。
在我们的调研中，受访者报告说，为了达到类似灌流工艺的产量，“可比的”(以随着时间推移的公斤产量，如每年)批次/补料分批生物反应器的尺寸通常需要是灌流生物反应器的3倍。目前，用于商业化规模生产时，大多数批次生物反应器的尺寸都是灌流式反应器的5倍左右，通常大于2000 L，甚至达到25000 L。这些>2000升的批次式生物反应器通常是不锈钢的。注意，本研究和模型仅限于使用一次性使用设备，有效地限制了≥2000L规模的灌流和批次生物反应器(尽管在经济模型中可以输入更高的体积；模型用户还可以计算规模扩展、并行运行多个生物反应器或生产线的成本)。
培养基体积和制备
与培养基体积与生物反应器体积大致相当的批次工艺相比，相当的灌流工艺所需的培养基随着时间的推移而增加，可达到生物反应器体积的数倍。例如，如果一个100 L灌流工艺以1VVD的灌流速率运行30天，需要的培养基体积=(100L)X(30培养基置换体积)= 3000 L。相比相当的批次工艺，灌流中的培养基成本显著增加。但与批次工艺相比，在灌流工艺中，每克(或公斤)活性药物的成本，特别是与工艺相关的总体成本，往往是相当或相对更便宜的。这通常是由于使用了规模较小、更便宜的生物反应器和设施。
用于灌流和批次工艺的培养基制备的频率在不同的工厂中差别很大。多名受访者表示，为灌流工艺做的培养基制备操作的重复次数太多，以至于有些情况下被视为一个相当“连续的过程”。“许多终端用户会在需要的时候提前几天准备一批培养基，并将其储存在袋子里。大多数人宁愿每两到三天准备一次培养基，以节省存储空间。有些人甚至可能每天都需要准备培养基，以支持灌流。一般来说，在批次工艺中(根据定义)，培养基准备只做一次。
准备好的培养基的存储是灌流使用者的主要挑战之一(同样的，灌流收获液的存储也可能是一个挑战)。工厂需要有大型的培养基储存罐(放在储存灌流液的大型储罐边上)。对于在存储袋或容器中存储培养基的用户，需要专用的冷藏室、冷柜或其它GMP级冷藏空间。尽管培养基的准备需要重复的工作，特别是灌流，大多数最终用户选择按需要准备培养基，而不是准备后长期储存。
在人工方面，近70%的受访者表示，通常有1-2名员工8小时轮班工作，以准备灌流工艺所需的培养基。他们还一致认为，与相当的批次工艺相比，准备使用量要求更高的灌流培养基所需的时间(人工小时)至少是批次工艺的3倍。报告的批次培养基制备的典型工时为1-2名员工3-5小时轮班工作。
浓缩培养基的使用
为了降低灌流工艺中所消耗的大量培养基的成本，更好地支持灌流效率，许多灌流用户更喜欢使用浓缩培养基进行细胞培养。使用浓缩的培养基可以节省存储空间和成本，因为需要准备的培养基的体积更小。然而，由于一些培养基成分的溶解度或稳定性的限制，使用高度浓缩的培养基会变得极具挑战性。在补料分批培养中，传统上使用补液形式的“分离”培养基，在一些灌流工艺中也发现了类似的使用。针对灌流使用的专利培养基现在可以获得高细胞密度、低CSPR以及高单位体积产率。
结论
与相当的批次工艺相比，灌流工艺可能会使用更多的耗材，主要包括ATF过滤器、一次性使用储袋、更多/更大的培养基和灌流液容器、接头、管路等。这增加了每次灌流工艺运行的成本。至少70%的受访者同意灌流方法通常比相当的批次工艺需要大约2-3倍的耗材。
蛋白质表达的产量是灌流和批次/补料分批工艺之间的主要区别因素。许多文章和研究人员在他们的研究中指出，灌流工艺可比相当的补料分批工艺生产更多的产物。虽然从一个典型的补料分批工艺中获得的单位体积产量可能等于0.3 g/L/d (克/升培养基/天)，稳态灌流工艺可以获得1-3 g/L/d的产率。超过50%的受访者同意这一观点。
几乎所有的受访者都同意，在进行极高体积的操作时，灌流工艺可能不是最经济、最便宜的选择。极大量的培养基置换，大大增加了物料成本和耗材成本；在某种程度上，随着规模的提高，更大的不锈钢工艺变得更划算，这是完全可以预料的。在这些更大规模条件下，批次式不锈钢工艺变得更加划算，产品成本更低。
由于培养基是对于任何一个灌流工艺来说都是主要的成本决定因素，强烈建议使用在低CSPR条件下，可提供最佳的细胞密度并提高产物产量的高质量、优化培养基，以降低整体灌流成本(除了有助于提高产物质量外)。也就是说，优化后的灌流培养基可能比模型计算的节省更多。
原文：R.A.Rader, E.S.Langer, Economics of Perfusion Culture Media and Upstream Processing. American Pharmaceutical Review, 2021.
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