基于模型的整合式连续“端到端”mAb平台设计和控制
本文摘自《Model-based design and control of a small-scale integrated continuous end-to-end mAb platform》，详细内容，请参考原文。
原文中，研究人员指出，连续整合式工艺已被用于工艺开发的极早期阶段，以便更简单、高效且更快地开发和表征整合式工艺，并进行药物候选物的小规模生产。文中提供的工艺是对极小规模条件下，连续“端到端”单克隆抗体（mAb）生产平台的概念验证，研究基于200ml交替式切向流灌流生物反应器，通过基于模型的设计和控制，整合纯化工艺。下游工艺，包括周期性双柱protein A捕获、病毒灭活、CEX和AEX柱，在单个层析系统中进行，纯化时间低于4小时。mAb以为期17天的CHO细胞高密度灌流培养生产，滴度达1.0 mg/ml。通过对所有层析步骤进行建模，创建了下游工艺的数字模拟。通过控制策略的实施，将这些模型用于实时决策制定，以实现工艺操作的自动化和优化。工艺的稳态操作确保了纯化抗体一致的糖基化模式。从杂质去除方面考虑，至少可达到4 log的HCP水平降低。纯化抗体的收率可达到60%，最高产量为0.8 mg/ml/day。
简介
单克隆抗体（mAb）及相关产品已被用于治疗多种不同的疾病。2015年，mAb的年销售额已达到900亿美元，占全球制药行业总销售额的60%。但是，由于治疗需要使用较高的剂量，此类生物药的治疗成本高达每个患者3万5千美元。用于mAb生产的大多数工艺基于批次操作：批次或补料分批生物反应器及随后的一系列批次纯化步骤，包括多个层析步骤、病毒灭活步骤以及过滤步骤。虽然这些传统工艺通常较为稳健且已良好表征，但由于市场需求的不断变化以及生物仿制药带来的竞争，其效率和灵活性往往有所欠缺。
不断增加的成本压力驱使生物制药行业开始寻找替代方法，例如连续生物工艺。尽管补料分批操作已可获得更高的产物滴度，但是相比在高细胞密度下操作的强化灌流工艺，其可获得的单位体积产量还是较低。连续纯化通过降低层析柱体积，提高填料载量利用，也可实现工艺效率的优化。上游和下游工艺的整合，即所谓的整合式连续工艺（ICB），可提高产量，降低设备尺寸，并从整体上降低生产成本。此外，在完全连续操作且自动化的端到端平台中，产物储存步骤可完全消除。
缺乏规模缩小模型以及连续工艺较长的开发时间，限制了工业化连续工艺的推广。从工艺开发的极早期采用ICB可加快新的药物候选物进入商品化生产，因其有利于实现工艺更简单、更安全的放大。此外，此类工艺可降低药物候选物小规模生产的压力，在目前，这是一项非常费力的任务，需要多个手动且低效的步骤。多项研究已经证实了ICB的潜力。实验室规模ICB的尺寸基于目前1.2-12 L的生物反应器体积，同时需要多个以独立控制系统操作的设备，才能完成所有纯化步骤。对于早期工艺开发和候选药物的表征或进行临床前检测批次生产时，这些设置的规模都过大了。
生物工艺的稳定操作需要工艺控制。这对于需要大量参数并将多个单元操作相连接的高复杂工艺来说，尤其如此，比如ICB。但是，一些控制策略需要的工艺信息不能从分析技术中实时获取。这个问题可以通过建模来解决。建模是一种非常有力的工具，不仅有助于获得对工艺以及理解特定参数对工艺输出的影响，也可以通过将实时信息连续用于稳健且自动化的操作，从而支持工艺控制。例如，基于模型的ICB模拟可以用于确定工艺参数，比如上样时间如何调节才能在纯化步骤中获得所需的结果，以及基于参数的实时评估，如收获浓度，以提高填料利用率。在本研究中，层析的数学建模提供了完整下游工艺的数字化版本。该数字复制版本的模拟相应地被用于设计下游工艺，并实现控制策略的执行。
本研究概念验证了在小规模条件下，用于纯化mAb生产的端到端整合式连续工艺。小规模系统的目的是建立设备数量尽可能少的紧凑设计，其基于配用交替式切向流（XCell ATF，Repligen）灌流的200ml工作体积生物反应器，以及用于所有下游步骤的单个小规模层析工作站（AKTApure，Cytiva）。为避免任何手动干扰，整个纯化工艺使用软件实现自动化和控制，以运行可执行建模支持的先进控制策略。
材料和方法
上游系统
生产mAb的两个中国仓鼠卵巢（CHO）细胞在200ml工作体积的DASbox Mini生物反应器系统中培养（Eppendorf）。细胞系分别为Cytiva 提供的CHO-K1细胞和由Cobra Biologics提供的CHO-S细胞。细胞从5 x 10^6 cells/mL的摇瓶接种至生物反应器，使用化学限定HyClone AcriPro培养基（Cytiva）。温度设定为37℃，通过向反应器顶部空间添加CO2，将pH维持为6.8。溶氧浓度（DO）通过氧气鼓泡，维持为40%。培养在灌流模式生物反应器内进行，使用配有0.45μm孔径和110 cm2膜表面积中空纤维过滤器的XCell ATF 2系统（Repligen，USA）。交替式切向流速设置为0.7 L/min。使用蠕动泵控制中空纤维无细胞收获滤液的流出，收获液转移至储存瓶，以用于层析系统上样。储存瓶为250mL无菌玻璃瓶，含三个端口，分别用作收获液入口、出口以及0.2μm空气过滤器连接。储存瓶置于外置天平（Kern）上。补液培养基组成包括92% HyClone ActiPro培养基（无葡萄糖）、7% HyClone CellBoost 7a以及1% HyClone CellBoost 7b。按细胞需求，补液培养基中添加葡萄糖，最终浓度达60 mM。接种后立即开始灌流，连续添加补液培养基并进行收获。步进式增加灌流速率，以达到目标细胞密度80 x 10^6 cells/mL，然后开始细胞废弃，以维持该值。在稳态条件下，细胞特异性灌流速率（CSPR，即灌流速率除以细胞密度）为25 pl/cell/day。
下游系统
下游物料：本研究使用典型的mAb纯化工艺，包括以下步骤：a）使用protein A填料MabSelect SuRe，结合等度洗脱，进行捕获步骤；b）病毒灭活步骤，pH 3.5，60min；c）使用填料CaptoS ImpAct进行阳离子交换层析（CEX）步骤，结合-洗脱模式，结合梯度洗脱；d）使用Capto adhere 填料进行阴离子交换层析（AEX）步骤，流穿模式。通常，还需包括最终超滤步骤，以在所需的浓度条件下，使用最终缓冲液，进行产物制剂。但是，由于超滤工艺需要更大的工艺规模，所以本研究中没有包括此步骤。
层析步骤使用柱体积1 mL的HiTrap 预装柱。较小的柱尺寸可方便通过连接多根层析柱进行所需柱体积的调节。所以，最低柱体积为1mL。运行条件，包括流速和缓冲液，基于供应商的推荐，包括用于捕获步骤的MabSelect SuRe填料以及用于离子交换层析步骤的Capto S ImpAct和Capto adhere 填料。两个FEP管用作病毒灭活步骤以及CEX和AEX步骤之间的产物保持。在病毒灭活的保持时间中，进行层析柱的淋洗、CIP和平衡，然后，病毒灭活的产物上样至CEX柱。
用于纯化的系统为AKTA pure 150单元，以UNICORN 7软件控制。系统包括以下模块：4个用于引导不同液流方向的通用阀（VV）、2个柱阀、2个UV监测器、1个pH传感器、1个电导传感器、2个作为三通阀的阀、1个上样至捕获柱的样品泵、以及梯度泵，包括泵A和泵B，用于层析柱漂洗和洗脱。
工艺示意图。橙色线表示连续捕获，其使用采样泵（SampleP）。这个泵控制储瓶中的重量，因此捕获流速与收获速率相同。蓝色线表示两根层析柱之间的连接，其连接两个不同的柱阀（ColV）。在图中，捕获柱A（1A）上样，捕获柱B（1B）洗脱。产物通过传感器组合，进行吸光度、电导率和pH检测，并上样至病毒灭活回路。其余的下游步骤包括CEX柱（3），及之后的驻留回路（4）和最后以流穿模式进行AEX步骤（5）。通过使用两个通用阀门（VV），捕获柱可进行周期性上样，阀有两个不同的位置，可加载一根或另一根柱。两个多用途阀门用于将液流导向一个柱阀或另一个柱阀（蓝线）。黑线代表不活跃的液流路径。右边简化的框图用于更清楚地解释这个过程。
工艺控制：下游工艺使用Orbit控制，这是一款由瑞典隆德大学化学工程部门开发的研究软件。软件可与UNICORN通讯，并以由工艺确定的及用户选择的次序，依序发送指令。为达到此目的，对软件进行了改良，以在特定的控制策略下，不进行人工干预，而可连续运行。Orbit可记录数据，并使用记录的数据执行控制策略。AKTApure单元安装在位于瑞典斯德哥尔摩的KTH，而从瑞典隆德大学监测下游工艺。所以，软件可以称为远程运行。
工艺建模：对所有下游单元操作进行建模和模拟，以根据预测的输出，预测用于做出工艺相关决策的信息。对于捕获步骤，采用Perez-Almodovar和Carta开发的一般速率模型及两个吸附速率（一个快速，对应指标i=1，另一个缓慢，i=2）。采用微分方程（1-3）和边界条件（1a）、（1b）、（2a）、（2b）对模型进行描述：
从protein-A填料流穿曲线的前端分析以及Langmuir等温线（Deff、qmax1、qmax2、K、k1和k2)的校准中获得了多个参数。轴向弥散和传质系数由经验关系式确定。通过Kozeny公式拟合至压降实验获得柱空体积，mAb SelectSure填料的颗粒孔隙度和半径摘自Pabst等报道。评估的生物反应器收获浓度和检测的流速用于流穿曲线的建模。该模型用于捕获步骤的上样，根据捕获层析柱的饱和度，确定循环的切换。
回路建模为一维弥散-对流输送（方程4），边界条件与方程（1a）和（1b）相同，其中轴向弥散由经验关系式获得。
CEX和AEX层析步骤，以及protein-A步骤的洗脱，采用盐依赖性（对于捕获洗脱，为pH依赖性）平衡常数（方程（5-7））的动力学模型建模，边界条件如方程（1a）和（1b）所示。通过拟合至实验洗脱峰和流穿曲线，获得这些模型的参数（H0、Dapp、qmax、k和β）。
所有单元集合并模拟，以创建下游工艺的数字版本。回路和离子交换柱采用轴坐标为50格点的有限体积法进行空间离散，在一般速率模型中，柱被离散为30格点，颗粒被离散为10格点。下游模型的求解通过同时整合常微分方程（ODE）和内置的、适用于刚性问题的MATLAB ODE求解器ode15s。
下游工艺中的设计参数概况
收获液浓度的评估：为进行下游工艺建模，有必要对收获浓度进行实时估计，而下游工艺反过来又被用于执行控制策略，从而实现工艺的自动化操作。浓度的计算方法为mAb的上样量除以上样体积。质量由CEX进口液流的吸收峰面积估算，即上样到此层析柱的液流。根据Maity等人的数据，使用消光系数1.4 ml/(mg cm)，可以估算出mAb的量，并假设其与捕获层析柱的上样量相同。此外，上样到捕获层析柱的体积根据来自生物反应器的流量计算所得，该流量连续在线检测获得。然后可以从mAb的体积和量来估计收获浓度。根据双柱捕获工艺的操作，此浓度对应于上一周期上样至捕获层析柱的产物。假设收获浓度在一个周期内保持不变，因此用该值来模拟下一个周期的下游工艺。在第一个下游循环中，由于没有上一个循环的信息，在开始下游工艺之前，通过离线浓度测量来确定收获浓度。
分析方法：使用BioProfile FLEX分析仪（Nova Biomedical）对每天从生物反应器中提取的样本，进行活细胞密度（VCD）、总细胞密度（TCD）和活性检测。使用Cedex生物分析仪（Roche）测定同一样品中葡萄糖、乳酸、氨和mAb的浓度。此外，从收获管路取样，测定mAb滴度。在线pH值每天与使用离线pH计进行的离线pH测量值进行比较，必要时对校准进行调整。
从每个周期的最后一个阴离子交换层析步骤获得的纯化mAb汇合至4℃存储瓶，一天进行一次收集并分装（−20℃），以做后续分析。mAb由光电二极管阵列检测器（Waters）在280nm处检测。mAb聚集使用体积排阻层析分析，以使用TSKgel G3000SW柱的HPLC系统（Waters，USA）进行，在280nm波长下检测。流动相为100mM Na2SO4和25mM Na2HPO4溶液（pH 7.0），流速为0.3 ml/min。mAb的N-糖基化分析使用GlycoWorks™ RapiFluor-MS™ N-Glycan试剂盒（Waters）进行。N-聚糖首先从mAb上分离，并用荧光团和碱性叔胺标记。然后在UPLC系统上用ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide柱（Waters）检测标记的N-聚糖。该方法以50mM铵溶液（pH 4.4）用于结合，以100%乙腈作为洗脱的流动相。使用荧光检测器在FLR波长Ex 265 nm/Em 425 nm处对标记的N-聚糖进行检测。使用CHO HCP第三代ELISA试剂盒（Cygnus）检测宿主细胞蛋白（HCP）。
在层析柱的出口，以280nm检测在线吸光度。对于捕获柱，由于过柱杂质的高吸光度，这些测量不足以检测柱上样过程中的产物流穿。因此，使用Cedex生物分析仪离线检测捕获步骤出口的mAb浓度，以确认层析柱上所有上样抗体的吸附情况。
结果和讨论
详细内容，请参考原文。
有和没有上样控制的整个下游工艺的模拟：（a）实验收获mAb浓度和流速。（b）在不采用上样控制策略的情况下，循环操作中下游工艺模拟的浓度趋势。（c）采用上样控制策略时，模拟的下游步骤浓度趋势。浓度峰值对应于每个循环中不同下游步骤的洗脱物。
CHO细胞灌流工艺的培养数据。（a）活细胞密度、活性和细胞特异性产率趋势。（b）生物反应器和收获液中的mAb浓度。
（a）长时间下游操作的第6和7天。暗和亮的区域分别对应周期性循环。（b）一个下游循环的放大图。红色峰代表每个柱/回路汇合的馏分。
（a）回收率和上游及下游产率的比较，表示为单位体积生物反应器每天的产物量。（b）工艺过程中，纯化产物的糖基化趋势。（c）收获液中的HCP浓度。
多篇关于整合式下游单元操作文献报导的数据参考。
总结
本文介绍了一种用于生物治疗药物生产的小规模ICB。使用以200ml ATF灌流生物反应器进行的高细胞密度CHO稳态操作，进行mAb的连续生产和收获。收获液以单个实验室规模系统纯化，采用整合3个层析步骤和病毒灭活的自动化下游工艺。借助于Tiainen等介绍的基于周期性双柱捕获的工艺，研究实现了纯化工艺的连续操作，且下游工艺通过研究软件Orbit进行远程控制。软件执行了一系列的控制策略，以配合收获液流速和mAb滴度的变化。研究开发了综合性下游模型，并使用模拟的数据，进行柱体积的设计和工艺的自动化，比如所执行的控制策略中的流穿曲线或洗脱峰。下游模型包括用于protein A捕获步骤的通用流速模型、用于精制步骤的动力学层析模型以及用于驻留回路的对流-弥散模型。自动化控制策略的结果，是获得了操作员人工干预最小化的长期连续生产工艺。整个生物工艺的稳态操作可获得稳定产物质量属性，如N-糖基化模式、一致的低HCP水平以及低聚体水平，整体工艺产量可提高至0.8 mg/ml/day，最高回收率为60%。
通过本概念验证研究，我们证实了连续工艺的技术可行性，其使用紧凑的设计，在单个设备中整合了多个上游和下游单元操作，且所需占地更小。
原文：J.Gomid-Fons, H.Schwarz, L.Zhang, et al., Model-based design and control of a small-scale integrated continuous end-to-end mAb platform. Biotechnol Progress, 2020, DOI: 10.1002/btpr.2995.
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