跳过种子扩增强化障碍，以最大限度地提高产量
本文节选自《Jumping Seed Train Intensification Hurdles to Maximize Yield》，详细内容，请参考原文。
克服时间和成本限制，有助于实现种子扩增工作的强化，以最大限度地提高产品产量。
在细胞培养过程中，通常通过种子扩增来提高产品产量；然而，这个过程可能是昂贵且耗时的。但是，种子扩增强化技术在获得接种到生物反应器所需的细胞密度，同时缩短种子扩增时间方面是有用的，这可以优化生物制品的产量。
“种子扩增是培养规模放大的过程，从细胞库冻存管中的小体积细胞到到用于以所需的细胞密度接种N罐或主生产反应器的大体积细胞。”Repligen过滤和层析业务高级副总裁Christine Gebski解释道。种子扩增过程旨在确保细胞活性，并达到所需的最终细胞密度。
MilliporeSigma生物工艺部门负责人Darren Verlenden表示同意:“种子扩增的目的是达到足够量的细胞质，以接种生产生物反应器，从而以一种最佳的方式开始蛋白质生产。”Verlenden指出，从工作细胞库小瓶到生产生物反应器，细胞数量必须增加大约6-8 logs。“这种[增加]通常是通过多种培养系统(如摇管、摇瓶、振荡式生物反应器、搅拌罐生物反应器)来实现的，这些系统随着传代的增加而变大。”
Verlenden说，虽然每个工艺都不一样，但典型的种子扩增是耗时且劳动密集型的，附加值相对较低。此外，失败的风险仍然很大，因为当工作细胞库小瓶被解冻，细胞被手动转移到层流罩下的摇管和摇瓶时，细胞扩增的早期阶段仍是开放的。
强化策略
采用种子扩增强化策略有利于整体的生产策略。正如Verlenden解释的那样，种子扩增强化的目的是降低生产成本，实现更高的工艺产出，并增加灵活性。
Gebski补充说，提高细胞库或N-1反应器的细胞密度，可以在更短的时间内达到“N”或主要生产生物反应器所需的更高的细胞密度。“减少工艺时间而显著提高效率，在给定的时间内完成更多工艺。获得更高的细胞密度与产量的增加直接相关– 即在一定时间内可以生产的生物药的数量。”
Verlenden说，生物制药行业目前正在评估或已经实施两种主要的选项，以强化种子扩增。这些选择都是基于灌流：N-1灌流和高细胞密度冻存(HCDC)。Verlenden解释说，灌流操作基于在生物反应器中以恒定速率引入新鲜细胞培养基，同时去除已营养耗竭的培养基，并使用细胞截留装置，将细胞返回到生物反应器罐中。他说:“通过这种方式，营养物质和废物含量在一段时间内保持稳定，这使得生物反应器中的细胞质水平更高。”
改进并简化的工艺控制和细胞截留技术是灌流技术被越来越多的采用，他说。Verlenden还指出，制药商正在评估在N-1生物反应器中实施灌流，以达到更高的细胞密度。“N-1灌流可以以两种不同的方式进行。第一种也是最有效的方法是使用N-1灌流使生产生物反应器具有更高的初始细胞密度，称为高接种补料分批。另一种使用N-1灌流的方法是通过获得更高的细胞密度，而使用更小的生物反应器并接种生产生物反应器。”Verlenden说，在这两种情况下，使用N-1灌流的优点是使生产生物反应器的操作保持为补料分批模式，这本质上简化了工艺验证，特别是产品获批后的工艺更改。
Verlenden说，此外，为了减少细胞扩增的持续时间，药品制造商已经开发使用更大的小瓶(5mL)的高密度细胞建库方法，这带来了一些改善，但没有减轻人工转移细胞造成的污染风险。“在HCDC设置下，通过灌流工艺，在100mL – 250 mL体积的一次性使用2D冻存袋中获得高细胞密度(100 - 150 x106 cells/mL)。从密度为100 x 106 cells/mL的 250mL一次性使用种子袋，你可以直接接种至20L的振荡式生物反应器或50L的搅拌罐生物反应器，以开始细胞扩增，从而减少步骤的数量，加快速度，”他说。
Verlenden还指出了使用HCDC袋的另一个好处，那就是使整个种子扩增链处于功能性封闭状态。他说:“在解冻袋子之后，你可以把它焊接到生物反应器上，并以无菌方式转移细胞，这样，制药商就可以在较低控制级别的区域内启动种子培养，从而节省环境检测的时间。”
从工艺控制和细胞截留技术的角度来看，无论是N-1灌流还是HCDC细胞建库，在种子培养中使用灌流都是进入上游强化的第一步。Verlenden补充说，灌流还提供了改善商品成本的机会，并从本质上提高了产品的安全性。
生物反应器调整
随着在生产工艺中使用种子扩增强化，生物反应器的设计已被调整，以跟上步伐，创新技术有助于这种适应。
Verlenden说，从生物反应器的角度来看，实现高细胞密度存在明显的挑战。例如，鼓泡和混合能力对于在最大限度地提高氧传质效率和最大限度地降低施加在悬浮细胞上的剪切应力之间实现正确的平衡至关重要。
“今天，kLa(氧体积传质系数)高达50/h，在2000 L规模下，单位体积的功率输入高达100 W/m3，正在成为一次性使用生物反应器的标准。生物反应器罐的几何形状优化、叶轮的设计优化以及钻孔鼓泡的多样化都有助于实现这些规格要求。”Verlenden说。
与此同时，他继续说，从一次性使用生物反应器的角度来看，用于3D培养袋的新的膜技术的出现更能抵抗机械性限制，减轻了一次性使用生物反应器在长时间灌流运行中的障碍。从强化种子扩增的角度来看，基于切向流过滤(TFF)的新技术使灌流变得更容易。这种基于TFF的新技术(Cellicon Solution, MilliporeSigma)是专门为种子扩增强化而设计的。[更主要的原因应该是TFF作为灌流技术用于长时间、连续产物滤出灌流时，由于膜污染所造成的产物截留等问题，而不太适用]。Verlenden说:“再加上现代化的生物反应器设计，这使得目前的灌流更有吸引力，特别是N-1灌流和HCDC细胞库的生产。”
Gebski补充说，经过验证且可规模放大的细胞截留设备(如Repligen的XCell ATF技术)已实现使用高达3000 L的N-1反应器接种15,000 L至18,000 L的反应器，并已在全球范围内被采用。她说，结合生物反应器设计和控制系统，XCell ATF设备通过强化的种子扩增而获得了更高的细胞密度。
协同效应和商业利益
种子扩增强化与一次性使用生物反应器和/或一次性使用技术一起使用是否有特别的协同作用，或者使用一次性使用生物反应器或不锈钢反应器的最终结果(最佳产量)是否相同? Verlenden表示，一次性使用与不锈钢的区别取决于生产环境。“一些公司已经选择在体积大于3000 L的不锈钢生物反应器中实施N-1灌流，以接种10 L到15,000L的不锈钢生物反应器，并以典型的补料分批模式进行操作。他说:“这使得大规模的商业化分子补料分批生产效率最大化，同时也利用了种子扩增强化的优势。”
Gebski也说，无论是使用不锈钢反应器还是一次性使用反应器，种子扩增强化过程和结果都是一样的。她说:“强化的种子扩增及其带来的好处继续在许多中、大规模细胞培养工艺中得到验证和临床或商业化应用。”
此外，她还强调了一次性使用部件和技术的实施，因为它们的实施时间更短，减少了设备清洁要求，并且易于使用。她说:“一次性使用并没有专门为种子扩增强化方法铺平道路，而是无论生物反应器类型如何，一次性使用和种子扩增强化方法都将效率提高注入了生产过程。”封闭式、一次性使用交替式切向流（ATF）装置的采用简化并加速了这种应用，甚至进一步来讲，与一次性使用工厂的趋势相一致。
Verlenden说，与此同时，随着蛋白质在生产阶段的灌流和连续收获在行业中越来越多地被采用，工艺规模扩展（scale out）的概念 - 而不是规模放大（scale up） - 将释放出它的全部能量。他补充说:“为了最大限度地提高工艺的灵活性，只有广泛使用一次性使用生物反应器和部件才能实现这一点。”
一次性使用技术的采用是整体工艺强化的一个关键推动力，Verlenden还说，并引用了Biophorum Operation Group 2017年发布的技术路线图为例。他指出，一次性使用技术的实现的好处是其更适用于种子扩增，而后者目前的典型早期阶段是手动且开放的。他解释说，一次性使用技术的使用，如HCDC袋，使整个上游工艺处于功能性封闭状态，这最终减少了洁净室分类所需的环境检测的负担和成本。
Verlenden继续解释说:“在更大规模的后期临床和商业化生产中采用强化的种子扩增工艺仍然比行业最初预期的要慢，这并不一定是因为一次性使用技术的缺乏或效率低下。”他说，业界长期以来的看法是，在种子扩增中使用灌流的培养基成本超过了增加产出和工艺灵活性所带来的好处。“虽然需要更多的培养基来运行N-1生物反应器的灌流，最近的成本模型数据清楚地表明，培养基的价格和成本对每克蛋白质生产的上游生产成本的影响[可以忽略]。更好地理解和使用工艺经济学模型可能会在未来改变行业的固有认知，”他总结道。
原文：F.Mirasol, Jumping Seed Train Intensification Hurdles to Maximize Yield, BioPharm International-03-01-2021,Volume 34, Issue 3.
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