通过代谢建模，靶向优化高密度接种工艺

来自德国勃林格殷格翰的研究人员在2021年1月的《Biotechnology and Bioengineering》发表了题为“Application of Metabolic Modeling for Targeted Optimization of High Seeding Density Processes”的文章。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。

摘要

通过在前期生物反应器中灌流模式的应用，以及随后在高接种密度(HSD)下接种细胞培养的工艺强化，有潜力满足对未来生产不断增长的要求。然而，工艺开发目前受到对这些工艺条件下细胞需求理解有限的限制。本研究的目的是利用扩展代谢物分析和代谢建模，来有针对性地优化HSD培养。通过对HSD N阶段培养的代谢产物分析，发现抑制性代谢产物在早期积累，而流量平衡分析得出了这样的假设，即活性氧(ROS)是导致细胞活性快速下降的原因。在代谢分析的基础上，采用了优化的补液策略，即添加乳酸和半胱氨酸，使抗体滴度提高达47%。流量平衡分析进一步阐明了乳酸和半胱氨酸惊人的协同作用，表明在这些条件下，增加乳酸摄取导致更低的ROS形成，而额外的半胱氨酸通过谷胱甘肽通路主动减少ROS。所提出的结果最终证明了工艺强化建模方法的好处，以及HSD培养在生物药生产方面的潜力。

简介

过去几年中生物药产品获批的增加，以及目前正在临床开发中的大量分子以及生物仿制药市场的预期增长，将对未来的产能构成挑战。与当前的标准补料分批工艺相比，连续生产有潜力极大地提高单位体积产量。在实现完全整合的连续工艺的过程中，可以使用灌流技术来增强现有工厂中目前在补料分批工艺。 与常规的补料分批工艺相比，在N-1阶段生物反应器中进行灌流以及随后在N期工艺进行高密度接种（HSD）的应用已被证实可提高空间-时间产量。

这项工作的目的是将扩展的代谢物分析和代谢建模应用于HSD补料分批培养的目标优化。尽管以前在文献中已对HSD工艺进行了一般性描述，但有关HSD条件下细胞代谢的信息仍然有限。到目前为止，据我们所知，只有Stepper等人使用转录组分析对HSD培养进行了更详细的研究，以获得对基因调控的进一步见解。在这项工作中，与标准补料分批工艺相比，对HSD工艺进行了详细的代谢分析，包括进行了流量平衡分析（FBA）。这种方法揭示了在HSD工艺中具有高细胞特异性生产率和高活性氧（ROS）形成的独特代谢阶段。基于此分析，在HSD工艺中采用了优化的补液策略，从而提高了细胞特异性生产率，获得了高的细胞活性，并最终使产物滴度大幅提高达47％。

材料和方法

细胞系、种子扩增和培养工艺

两种产单克隆抗体（单抗A和B）的专利CHO-K1 GS细胞系(细胞系A和B)使用化学限定培养基培养。种子扩增培养在摇瓶中进行，直到N-2阶段。N-1灌流培养在2 L一次性使用生物反应器(SUB)系统 (UniVessel®，Sartorius Stedim Biotech)中进行，灌流系统为KrosFlo® KML™ 50 (Repligen)，其使用一次性使用定制流路(ProConnex®，Repligen)，由孔径为0.65 μm的改性聚醚砜(mPES)切向流过滤(TFF)膜(MiniKros®，Repligen)组成。循环以KML™ 50单元中的磁悬浮离心泵实现。循环流速和灌流速率以KML™50系统根据特定的设定值控制。用于高接种密度(HSD)和标准补料分批(STD)工艺的N-1灌流培养进行6天，每24h以反应器体积(RVD)调整灌流速率。HSD和STD补料分批培养分别从N-1灌流培养中以10x10⁶ cells/mL (HSD)或0.7x10⁶cells/mL (STD)接种，并在3 L玻璃生物反应器(Applikon Biotechnology)中进行长达14天的培养。pO₂、温度、pH和P/V设置在HSD和STD补料分批工艺中保持一致。从第0天(HSD)或第1天(STD)开始连续补液，直到整个工艺结束。按需向工艺中加入葡萄糖。测试的HSD工艺包括HSD LAC、HSDLAC/CYS和HSD CYS培养，分别添加乳酸钠(标准:≤2g /L至3g/L)和/或半胱氨酸(固定:第1天至第5天)。

过程中分析和LC-MS/MS检测，请参考原文。

流量平衡分析

流量平衡分析（Flux balance analysis，FBA）是在代谢网络的基因组规模重建中模拟代谢的数学方法。与传统的建模方法相比，FBA在构建模型所需的输入数据方面要求不高。使用FBA进行的模拟计算成本低廉，并且可以在现代个人计算机上，几秒钟内计算大型模型的稳态代谢通量。

流量平衡分析(FBA)通过软件Insilica Inspector™(Insilica Biotechnology AG)进行。该软件使用先前Schaub等人所述的CHO-K1细胞系基于基因组的代谢网络模型。FBA是在类似Popp等人报导的恒定生长和特定代谢速率的代谢稳态下进行的。与Ivarsson等人报导类似，作为一个目标函数，ATP产量的最大化被用于计算细胞内流量。根据Wahrheit等人的说法，糖酵解活性是由果糖-1,6-二磷酸转化为甘油醛-3-磷酸的流量定义的，而三羧酸酯活性则是在乙酰辅酶A的加入下，由草酰乙酸形成柠檬酸盐。ROS的产生速率是根据电子传递链中复合物I的流量计算的，因为这是线粒体ROS产生的主要来源。

结果

详细的实验结果，请参考原文。

图1.（A）VCD和活性、（B）滴度、（C）天冬酰胺、（D）乳酸和氨浓度，（E）2-脱氧胞苷浓度，（F）DL-吲哚-3-乳酸浓度，（G）吲哚-3-羧酸浓度和（H）2-羟基丁酸浓度随工艺时间的变化。 所有实验均重复2次（n = 2）。 垂直虚线表示HSD和STD培养物中细胞活性下降的时间点。

图2. STD培养（A和B；n = 2）和HSD培养（C和D）在整个工艺时间内的代谢阶段P1至P5和相应的细胞特异性生长速率（μ）和特异性乳酸产量（qLac）；n = 2）。

图3.（A）STD（n = 2）和HSD（n = 2）工艺代谢阶段特异性氨基酸、葡萄糖、乳酸和氨的摄入和释放速率的热图。（B）STD（n = 2）和HSD（n = 2）工艺糖酵解（GLYC）、TCA循环（TCA1-4）、磷酸戊糖途径（PPP1-3）的细胞内流量的热图以及代谢阶段的TCA与糖酵解活性的比率（TCA / GLYC）。

图4. HSD（蓝色，n=2）和STD（灰色，n=2）工艺的细胞内流量、ATP和ROS的形成以及代谢阶段1至4(A-D)的特异性细胞生长(μ)和特异性产率(qp)。所有的流量按所有代谢阶段和培养的最高流量归一化。

图5. HSD培养(A和B;n=2)和添加乳酸的HSD培养(HSDLAC) (C和D;n=2)和添加乳酸及半胱氨酸的HSD培养(HSD LAC/CYS) (E和F;n = 2)工艺时间内代谢阶段P1到P5和相应的细胞特异性生长率(μ)以及特异性乳酸产量(qLac)。

图6. (A) HSD培养(n=2)和添加乳酸的HSD培养(HSD LAC;n=2)以及添加乳酸和半胱氨酸的HSD培养(HSD LAC/CYS;n = 2)代谢阶段特异性氨基酸、葡萄糖、乳酸和氨摄取和释放速率的热图。(B) HSD 培养(n=2)和添加乳酸的HSD培养(HSD LAC;n=2)以及添加乳酸和半胱氨酸的HSD培养(HSD LAC/CYS;n = 2)代谢阶段糖酵解、TCA循环、戊糖磷酸途径细胞内流量以及TCA与糖酵解活性比值的热图。(C) HSD LAC和HSD LAC/CYS培养的特异性乳酸摄取(qLac)与特异性葡萄糖摄取率(qGlc)的相关性。

图7. HSD (蓝色;n=2)和HSD LAC/CYS(绿色;n = 2)工艺代谢阶段3（A）和4（B）的细胞内流量、ATP和ROS的形成以及特异性细胞生长(μ)和特异性产率(qp)。所有的流量均按所有代谢阶段和培养的最高流量归一化处理。半胱氨酸代谢用灰色阴影表示，因为半胱氨酸测量没有包括在FBA中。

图8. 用于细胞系A (A- D)和细胞系B (E-H) 的优化HSD培养的工艺性能。(A)工艺时间内的 VCD 和活性以及(B)乳酸和2-羟基丁酸。(C) HSD、HSD LAC和HSD LAC/CYS培养整个工艺期内的特异性生产力的平均值和范围。(D)与STD补料分批相比，HSD培养的产物滴度在培养期间的变化。(E) 工艺时间内的VCD 和活性和(F)乳酸和2-羟基丁酸。(G) HSD、HSD 和HSDLAC/CYS培养在整个工艺期间特异性产率的平均值和范围。(H)与STD补料分批相比，HSD培养的产品滴度随培养时间的变化。A细胞系的所有实验重复2次(n=2)。B细胞系实验次数略有差异，分别为STD (n=2)、HSD (n=6)、HSD LAC (n=3)、HSD LAC/CYS (n=2)和HSD CYS (n=1)。

总结

与常规的补料分批工艺相比，通过N-1灌注和随后的高密度接种（HSD）培养进行的工艺强化可以显着提高空间-时间产量。不少文献已经介绍了HSD培养，但是关于HSD条件下细胞的代谢状态的数据有限。在这项工作中，与常规补料分批工艺相比，扩展的代谢物分析与结合流量平衡分析（FBA）一起用于HSD培养的表征。对潜在的抑制性代谢产物的分析表明，这些物质在HSD培养中较早积累。与Muluktula等人的工作类似，未来的工作可能会通过针对其代谢前体的培养基调整，来应对这些代谢物的减少。但是，这项研究的主要目的是提高细胞寿命和特异性生产率，而不在于进一步增加峰细胞密度。流量平衡分析的确揭示，在HSD培养物中，具有高ROS形成和高细胞特异性生产率的独特代谢阶段。根据这些结果，调整了补液策略，向培养中添加乳酸和半胱氨酸确实改善了工艺性能。用细胞系A和B证明，补充乳酸和半胱氨酸具有很强的联合作用，表明这两种培养基成分对细胞的代谢产生协同作用。尽管用乳酸额外添加的培养物确实减少了细胞内ROS的形成，但进一步添加半胱氨酸可能导致通过谷胱甘肽途径主动减少细胞内ROS。因此，两种培养基成分均有助于改善细胞内ROS平衡。有趣的是，添加乳酸的培养物确实显示出提高的细胞特异性生产率。在这些培养中，代谢物2-HB明显升高，表明它可能与其化学类似物（例如3-HB和NaB）一样，与生产率的提高相关。通过抗氧化剂化合物（如维生素，硫醇或α-酮酸）的培养基优化以及基因工程方法，可以进一步减少ROS物质，从而可以进一步提高HSD工艺中的培养寿命。同时，通过温度变化或培养基成分（例如丁酸钠、戊酸或白藜芦醇）诱导细胞周期抑制，从而提高特异性生产率的策略，可以增强HSD培养的产量。

最后，在本研究中代谢建模方法的应用可获得优化的HSD培养，其滴度增加高达47％。基于收集的数据和代谢分析，将来可以应用其它针对性的优化策略，因为研究认为HSD培养的潜力仍未完全实现。

原文：M.Kolb, A.Keitel, F.Stiefel, et al., Application of Metabolic Modeling for Targeted Optimization of High Seeding Density Processes. Biotechnology and Bioengineering, 2021, https://doi.org/10.1002/bit.27693.

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