连续生物生产和COVID-19时代的病毒检测
保持生物制药产品无病毒的技术必须适应连续工艺以及被COVID-19破坏的供应链
Samsung Biologics是一家合同开发和制造机构（CDMO），该公司表示，已经开发了一个平台，可将六个纯化程序整合为更快、更经济的两步工艺。据该公司介绍，在纯化200L的产品运行时，两步工艺比传统工艺快25%，成本低20%。图片来源：https://www.genengnews.com/
将细胞转化为微型“药厂”的能力给医学界带来了一场革命，使开发人员能够为更广泛的疾病创造出更具针对性、也更有效的疗法。但是建立以细胞为基础的生产系统是有代价的 - 有可能引入病毒污染。
尽管业界做了很多工作，但用于生物药生产的细胞系可能携带病毒，如果不从终产品中去除，就会影响患者。为了对抗病毒污染，很多公司已经开发了各种病毒去除和灭活策略。
工作流和时间线
病毒安全策略的有效性依赖于所制备的药物、用于生产药物的细胞系和试剂、以及工艺步骤的功效，爱尔兰国家生物工艺研究和培训所高级生物工艺培训师及培训协调员Shada Warreth说。
“有几种方法可以清除病毒，”她继续说。“然而，最常用的方法是pH灭活，这通常用于囊膜病毒，以及除病毒过滤，这通常用于无囊膜病毒。”
“这些病毒清除方法的最大挑战(涉及处理过的)溶液通过除病毒过滤器，这种过滤器的孔径非常小。我们说的是纳米。(另一个挑战)是确保处理过的溶液保持无病毒状态，直到最后一个容器(比如小瓶或注射器)灌装并密封为止。”
制药公司利用除病毒研究来确定清除步骤是否有效。MilliporeSigma工艺解决方案主管Andrew Bulpin博士说，这类研究存在一定的实际挑战。
“最大的挑战是管理这些研究的时间线，”他详细说。“在下游纯化工艺完成并有足够的中间体材料可用于除病毒spiking研究之前，不可能安排研究。”
除病毒研究需要与合同研究机构（CRO）协同安排。当急需开始临床试验时，管理这些时间线甚至会成为一项更大的挑战。”
Bulpin补充说，除病毒研究已经以类似的方式进行了25年以上，变化很少，这些研究中使用的方法通常都已经进行了很好的表征。“然而，”他警告说，“监管机构不会允许使用通用清除数据，以降低成本或缩短与工艺验证相关的时间。从事这些研究的合同研究机构数量有限，因为能力的限制，进入这个市场的新参与者也很少。”
连续生产问题
对于基于批次的生产，病毒清除和灭活方案已经良好建立且已证明有效，即使其在专业知识和能力方面有特定的要求。不太为人所知的病毒安全性挑战来自于连续生产。在过去的十年里，生物药制造商为了提高效率和降低成本，开始越来越广泛地使用连续生产。
根据Warreth的说法，连续生产所带来的技术要求对于设计用于批次模式生产的系统来说，会是一个不小的挑战。她解释说:“在传统生产中，会有多个离散的工艺步骤，其工艺时间更长，而连续生产中不同步骤之间的滞留时间更短。然而，一旦发生污染，就会出现难以回答的问题。会损失多少工艺料液?在连续工艺中污染发生在哪里?批次从哪里开始和结束?”
麻省理工大学(MIT)的生物工艺工程研究员Moo Sun Hong也同意这一观点。
他说:“与传统生产系统相比，单克隆抗体和其它生物制品的连续生产具有许多优势，包括成本更低、工艺时间更短、产品一致性和质量更好，因此吸引了人们极大的兴趣。然而，连续生物生产过程中的一个重要挑战是如何整合有效且连续的病毒灭活系统。”
“病毒灭活技术，包括低pH保持以灭活囊膜病毒，对于最大限度地降低病毒污染风险以及确保患者安全至关重要。此前发明的将低pH保持集成到连续工艺的方法缺乏对关键工艺参数的充分控制，如操作pH以及停留时间。需要可以集成到连续生物生产过程中、并可严格控制的病毒灭活系统，以确保产品质量和安全性。”
为了解决这一需求，Hong和他的同事开发了一种系统，可以精确控制病毒灭活期间的pH值和停留时间。将含有生物制品的输入溶液与酸混合，泵入玻璃填充柱中，在那里孵育足够的时间，以使囊膜病毒灭活。
流体的pH值由传感器监测，并使用基于模型的反馈控制方案进行严格调节。此外，通过反示踪实验周期性地测量停留时间分布，并用于调整进料流速。
Hong和他的同事已经证明了这种方法对病毒灭活有显著的影响。“我们证明，”他指出，“反馈控制方案能够快速且准确地调节溶液的pH值，具有快速启动和有效的干扰抑制。我们进一步确定，该系统能够正确识别停留时间的变化，并调整进料流速，以满足停留时间设定值。”
“这种对pH和停留时间干扰的抑制，对于确保有效的病毒清除以及产品质量的最小变化至关重要。将这项发明整合到连续生物生产系统中，可以提高产量，优化产品质量，并增强患者的安全性。”
特定于产品的方法
对于某些生物药产品，不管其生产方式如何，病毒灭活或清除的标准方法根本不适用。例如，疏水性单克隆抗体在用于病毒灭活的pH范围(即pH 3.4-3.6)内可能不稳定，且容易聚集。
因此，研究糖基化抗体或基于IgG2和IgG4的产品的研究人员需要其它的病毒灭活方法，Incyte大分子纯化副主任Green Guihang Zhang博士说。
“疏水性单克隆抗体通常在pH值4.0或更高时是稳定的，”他解释说。“然而，在pH值4.0时进行病毒灭活并不可靠，通常需要超过120分钟的孵育时间，才能达到完全的病毒灭活，而在pH值3.4-3.6时，病毒有效灭活只需不到15分钟。”
目前，病毒灭活的替代方案包括Triton X-100和Triton CG-110等去污剂，或三正丁基磷酸盐/聚山甲酸酯20等溶剂/去污剂组合。这些替代品可以在接近中性pH的条件下灭活囊膜病毒。辛酸、精氨酸或精氨酸衍生物可能在微酸性pH条件下有效，而在此类条件下，疏水性单克隆抗体通常是稳定的。
Incyte公司开发了一种混合方法，将低pH灭活与物理处理方法结合起来。Zhang断言，这种方法比其它方法更有效。
“我们的建议是将pH 4.0的低pH病毒灭活与纳滤方法结合或整合使用，作为一个连续的过程，后者通常持续120分钟以上，”他解释说。“通过这种方式，我们可以消除常规低pH病毒灭活过程中的孵育时间。连续的病毒灭活和纳滤消除了单独的病毒灭活孵育步骤、为克服液滴‘悬挂效应’所需的容器转移以及病毒灭活后的中和步骤，从而简化了整个纯化工艺。”
组合方法
组合技术也是Samsung Biologics开发的新型纯化平台的关键，Samsung Biologics是一家合同开发和制造机构（CDMO）。Beomkyu Kim博士是该公司下游工艺开发的首席科学家，他表示，新平台将六种工艺合并为两步纯化程序，其源于公司认为有效的三阶段纯化程序，但后者相当耗时且成本高昂。
有了这个新平台，纯化程序的第一步将包括Protein A层析柱，并完成病毒灭活和深层过滤。第二步包括多模式(MMX)层析柱，并完成纳滤和超滤/洗滤(UF/DF)。
“与其它纯化平台相比，不同之处在于第二根层析柱，”Kim说。“新平台使用MMX层析，并使用实验设计（DoE）方法来确定Protein A和MMX层析的关键操作参数。”
Kim报告称，该两步程序使Samsung Biologics可以将200L产品的纯化成本降低20%，并将工艺时间减少25%。
此外，根据Kim的说法，在通过两步系统的工艺液流中，高分子量污染物低于2%，宿主细胞蛋白质水平低于100 ppm。
“两步纯化平台已被应用于两个项目，今年该平台将用于临床生产，”Kim补充说。“据我们所知，两步纯化平台的应用目前还不是一种常见的方法。因此，该平台的应用有助于减少我们的开发时间和成本，并获得高产量和纯度。”
Samsung Biologics，一家合同开发和制造组织，表示其GMP标准的纯化链由配备完全的层析、超滤/洗滤以及除病毒过滤系统的工艺车间所支持，适合处理宽泛滴度条件的生产。图片来源：https://www.genengnews.com/
除病毒与COVID-19
COVID-19大流行打乱了所有国家所有行业的运营，生物工艺行业受到的打击比大多数行业都要严重。除了破坏生物制药行业所依赖的复杂供应链外，大流行还增加了对技术和服务的需求，因为开发人员急于开发疫苗和治疗方法。
MilliporeSigma的Andrew Bulpin说:“我们已经看到了行业对快速进行除病毒研究的需求的增加，以使疫苗和治疗方案尽快开始临床试验。通常，这些研究需要提前6到9个月计划，以便有足够的时间执行这些研究和监管审查。
“大流行突显了加快这一时间线的必要性。大多数治疗COVID-19的新疗法是重组蛋白，因此会有一个通用的下游工艺流程，包括经过充分研究的病毒降低步骤。
“可以认为，计算机建模可以用来估计下游工艺过程中的一些甚至所有可能的病毒对数降低步骤。如果这被证明是可靠的，那么对实验室研究的需求就会被消除，或者至少大大减少。
“另外，病毒清除的问题之一是提供足够数量的病毒来进行这些spiking研究。多年来，除了活的哺乳动物病毒，人们提出了许多替代方案。像噬菌体或纳米颗粒这样的模型可以更快地制造，并有能力产生更高的降低值。由于以往一般会有足够的时间来使用更“适当的”哺乳动物模型病毒，这些方法没有得到采纳；但是，在紧急情况下，可能需要对这些模型进行重新评估。”
原文：G. J. Macdonald, Viral Testing in the Era of Continuous Biomanufacturing and COVID-19. GEN. 2020.
相关阅读：
Samsung Biologics相关新闻：
连续生物工艺相关文章：