交替式切向流（ATF）的计算机流体动力学建模
来自美国凯克研究所Amgen生物工艺中心、澳大利亚阿德莱德大学等的研究人员在2018年第115期的《Biotechnology and Bioengineering》杂志上发表了题为“Computational fluid dynamic (CFD) modeling of alternating tangential flow (ATF) filtration for perfusion cell culture”的文章。文中，研究人员指出，交替式切向流（ATF）过滤作为一种低剪切的细胞分离设备，已经被许多基于灌流的工艺所成功采用。相比切向流过滤（TFF），ATF每个循环中的反向液流被用于降低污染。目前，ATF系统的建模主要基于经验推导的公式，导致模型参数过于简化。在此研究中，研究人员使用一种经实验验证的CFD模型，使用水和上清溶液，来预测ATF膜中局部的流体行为和压力分布。研究结果为椋鸟流动（Starling flow）现象提供了数值证据，该现象已经理论化，但此前未被验证用于当前的操作参数。此外，结果显示，错流流速会显著影响局部的通量分布，更高的错流流速可提高局部滤液通量、以及可逆和不可逆的污染阻力。此外，灌流生物反应器膜中往常使用的2 LMH的低平均滤液通量可实现在每个加压和排气阶段，约有50%的膜长度被用于滤液流出，即在一个ATF循环中，实现完整的膜利用。总结来说，初步的CFD结果显示，局部通量和阻力分布进一步阐释了在基于灌流的系统中，ATF膜污染的动力学特性。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
简介
灌流生物反应器是目前数项研究的主题，因其有潜力实现治疗性蛋白和抗体的连续工艺和商品化生产，获得一致的产物质量。已有多种技术被开发用作灌流系统，但是基于微滤的切向流过滤（TFF）和交替式切向流（ATF）是灌流生物反应器最常选择的细胞分离技术，因其在灌流细胞培养中，可稳健地支持极高的细胞密度。
在典型的灌流生物反应器中，细胞悬液连续泵动通过TFF或ATF系统中的中空纤维，以分离含有目的蛋白的耗竭培养基和细胞。耗竭的培养基（滤液）进一步下游处理，以纯化蛋白质产物，而细胞返回生物反应器，与此同时，向生物反应器补加新鲜的培养基，以替换滤出的耗竭培养基。ATF系统（Repligen）的独特之处在于其用于在中空纤维组件内形成交替式液流的隔膜泵和控制系统，其与TFF系统中单向流动的操作模式不同。在加压阶段，隔膜的空气腔被加压，推动液体通过中空纤维，进入反应器。然后在排气阶段，空气离开真空泵的腔体，将液体“拉”回隔膜的液体腔。
基于中空纤维的灌流生物反应器具有诸多优势，这已在多篇文章中得到了证实。但限制其被更广泛采用的一个主要问题是膜污染和产物截留。产物截留对于稳定操作来说，是一个特别重要的现象，其是指膜维持滤液和回流液中所需蛋白质产物浓度的能力。但是，通常由于膜污染，蛋白质在回流液中的截留会随时间增加，导致工艺控制降低，且可能导致产物损失。
浓差极化和膜污染对产物截留有决定性的影响。前者是可逆的，其主要是由于蛋白质在膜表面的积聚所导致。后者是不可逆的，其通常与细胞、细胞碎片、颗粒物和细胞外物质在膜表面和/或其膜孔内的积聚相关。
已有不少研究专注于对作为细胞截留设备的ATF系统性能进行表征，而在与TFF的比较中显示，ATF在低剪切、降低污染以及产物截留方面具有更出色的表现。在ATF系统的排气循环中，在膜上存在反向液流的可能性，其被认为可降低污染，这可能是由于纤维外侧的液流反向回到纤维内腔。这被称为椋鸟巡回现象，被认为是去除沉积的物料的原因。
多种模型可用于描述导致通量衰减的不可逆膜污染，包括基于蛋白质吸附、膜孔堵塞以及表面沉积模型的一系列模型中的阻力。但是，关注对ATF系统中的污染进行表征的研究不多。此外，在每种情况中，模型的验证需要关于膜结构特性的详细信息，包括其厚度、孔径、孔隙分布和孔隙度以及局部液流条件，包括大部分区域以及接近纤维腔壁的轴向和径向流速以及压力降。通常，由于缺少局部液流信息，会导致模型参数过于简化。之前也有研究表明，细胞培养上清液会导致膜污染，而与细胞悬液无关。本研究的目的是使用计算流体动力学（CFD），对ATF系统中，细胞培养上清液通过多孔膜的流体进行研究。这是建立膜污染和筛分衰减预测模型的第一步，可用于指导基于中空纤维的ATF系统的工艺设计和优化。
实验和材料
实验研究
本研究报告的所有实验使用小规模灌流生物反应器系统。由Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc（Fremont，CA）提供的一种表达重组单克隆抗体的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系在2L灌流生物反应器中培养29天。从第10天开始，峰细胞密度维持为~30x10^6 cells/mL。细胞培养上清液在第29天收获，细胞活性为75%。细胞培养液以243rcf离心（CS-6R，Beckman Coulter）20分钟，以从上清液中分离细胞和较大的细胞碎片。此前，Wang等报导，膜暴露于经0.2μm膜过滤的滤液或含有重悬于滤液的细胞的溶液，不会影响其蛋白质筛分。但是，当细胞培养上清液中含有的颗粒的主要粒径范围为100nm左右时，中空纤维膜的产物筛分性能严重下降，且几乎在瞬间发生。
实验使用ATF 2H和C24控制系统，配置聚醚砜（PES）膜（S02-P20U-10-S，Spectrum），组件含有75根纤维，膜表面积为470cm2，膜孔径分布的平均值为0.2μm，纤维长度为20cm，纤维内径为1mm。使用Hitachi SU-70扫面电镜（Hitachi，USA）检测的膜厚度（纤维壁）约为140μm，每个实验使用一根新膜，不做预处理。
基于小规模ATF灌流系统的示意图。
上图所示为ATF设置。容器内含有250mL水或细胞培养上清液，以不同的错流流速（表1）循环通过膜组件，并返回至容器。不同错流流速的ATF循环时间按以下公式计算：
通过将回流液和滤液均循环回到容器，保持其恒定体积。使用蠕动泵（114DV，Watson Marlow）维持2 LMH的恒定滤液流速。在组件的入口、出口以及滤液管线安装一次性使用压力传感器（Scilog，USA），以监测循环过程中的压力变化，如上图所示。压力值使用压力监测器记录（精确度±0.02psi），数据使用SciPress数据采集软件每秒采集。中空纤维组件出口安装流量计（Leviflow LFSC-S系列，Levitronix），以记录在加压和排气循环中的流速变化。流速值使用动态控制系统读取并采集（精确度±1%）。
水力学过滤阻力基于已建立的方法检测并使用以下Darcy公式计算：
其中，J为滤液通量[m/s]，TMP为跨膜压[kg/ms2]，μ为滤液粘度[kg/ms]，Rt[m-1]为操作过程中的总体膜阻力，Rm[m-1]为可逆的污染阻力。通过去离子水在设定的TMP值下流动通过膜，获得干净的膜的阻力，Rm。获得的Rm值用作使用水时的CFD模拟的输入参数。对于上清液实验，计算操作过程（6h）中的总体膜阻力，Rt，并用作使用上清液的CFD模拟的输入参数。实验终止时，上清液进样切换为去离子水。从进样切换前后，总滤液阻力的差异，获得可逆性污染引起的过滤阻力，Rrev。然后，从总过滤阻力中减掉其它阻力，计算不可逆的膜污染导致的阻力，Rirr。Rrev和Rirr值用于比较不同操作条件对膜阻力变化的影响。
从工艺液体切换为水，以检测膜可渗透性，可能会导致溶解的物质发生沉淀，进行形成污染。我们仅在使用上清溶液的特定条件下，观察到膜污染。但是，在膜暴露于蛋白质溶液或培养基之后，再切换为水作为进样，没有观察到污染。所以，使用水作为液体切换，以检测水力学阻力。
CFD模拟
所有CFD模拟以单根多孔纤维建模，假定所有纤维入口和滤液流速平等分布。下图所示为使用ANSYS FLUENT 18.2版本生成的2D轴对称单根纤维模型。下图A所示为由内腔、膜和外壳区域组成的模型。针对2D纤维，使用一个单元四边形网格（下图B）。网格密度的选择基于网格无关性研究，在膜边界较高的分辨率提供了最准确的结果，并经实验验证。
用于ATF系统中单根纤维的CFD模拟的几何和计算网格。（A）以进口、出口外壳及出口管腔作为边界条件的纤维2D轴对称示意图（红色部分）。（B）纤维网格放大图。暗区域代表沿膜边缘的网格细化。
研究设计了一个瞬态层流单相模型，以对纤维内的交替流进行建模。液体假定为牛顿流路，且不可压缩。粘性液体流动以连续性和Navier-Stokes公式的基本原理控制，在柱坐标下可写成：
其中ρ为液体的密度（kg/m3），v为液体流速（m/s），r和z代表径向和轴向坐标（m），μ为液体流速（Pas），P为压力（Pa），g为重力加速度（m/s2）。采用SIMPLE压力-流速耦合算法及动量和压力二阶迎风离散格式（ANSYS Inc. USA）。动量和连续性的收敛标准选择为10-4，模型根据各错流流速条件的泵循环时间瞬态运行（表I）。
ATF研究使用的实验参数和条件。
在纤维入口处设置了随时间变化的流速趋势边界条件。在单个循环中，通过ATF出口流量计实验检测的进样流速，对随时间变化的流速趋势进行计算（表I）。假定液流在所有的中空纤维中均匀分布，所以组件的质量流速规模缩小为单根纤维（除以75根纤维），通过将体积流速除以纤维横截面积，计算流速分布。纤维的出口边界设定为大气压。通过假定所有纤维的滤液通量均匀分布，设定外壳边界条件。外壳平均流速为2.55x10-4m/s，计算基于外壳面积和滤液质量流速。外壳平均流速与2 LMH的滤液流速对应。
管腔的多孔性区域使用从此前描述的实验性流体阻力获得的阻力值以及从生产商获得的0.65的孔隙度，进行建模。然后滤液通量分布作为阻力以及内腔一侧和外壳一侧的跨膜压差的结果。局部滤液通量计算基于流速的径向分量。
结果和讨论
CFD模型验证
此前，已使用一系列经验推导的公式对ATF进行了建模，在此类公式中，重要的参数，如局部流速、压力降和滤液通量，被集中为单个平均值。本文提出的CFD方法为更好地理解操作条件对性能的影响提供了基础，如产物筛分以及膜利用。使用实验性膜阻力作为模拟输入，开发了一种2D轴对称CFD模型。一个循环中的平均进样压力和滤液压力作为输入，以基于实验数据对模型进行验证。均方根误差分析表明，实验结果和CFD输出之间良好吻合（表II）。
实验和CFD模型根平方差（RMSE）差异。
下图进一步验证了一个循环中（排气和加压阶段）压力的CFD模型和实验趋势。从下图a中可见，模拟的入口压力趋势与实验趋势在整个循环中都非常接近，且在整个进样错流流速范围内保持一致。下图b所示为一个循环中，CFD和实验滤液压力趋势。与观察到的进样压力趋势预测一样，滤液压力趋势与使用水作为流体的CFD模式高度吻合。如下图所示，可以认为简化的单纤维CFD模型正确预测了中空纤维组件轴向和径向的进样及滤液压力趋势。
在0.11、0.22和0.7m/s的进样错流流速（CFV）条件下，单个ATF循环中，CFD模拟的和实验获得的水进样压力趋势（a）和水滤液压力趋势（b）的比较。CFD进样边界条件表示为单个循环中，流量计实验检测的流速分布。出口管腔设置为0[Pa]。滤液流速保持恒定为0.000255m/s，相当于滤液通量2LMH。
ATF系统中的液流和压力模式
相比TFF系统，ATF系统有诸多优势，且已被诸多灌流工艺所采用。但是，最近有研究报道，在特定的条件下，ATF中的产物筛分能力没有充分实现。此类系统中压力和流速复杂空间及时间变化的CFD模式可能可为了解操作参数如何影响灌流生物反应器的产物筛分提供一些见解。
上图所示为在加压阶段的单个时间点（10秒）中，在0.11m/s的进样错流流速条件下，纤维入口、中央及出口区域的轴线及径向水流（不同颜色表示流速大小）。上图a所示为计算域中使用的单根纤维，代表整个组件的液流。上图b所示为纤维内腔中央区域的预测层流模式。模型预测在膜的中央区域（10cm）发生椋鸟流动，以径向流速方向的变化表示（如箭头方向的变化所示）。下图c阐释了文献所报道的多孔膜内椋鸟流动的机制，其是由内腔和外壳区域之间的跨膜压差的变化所导致的。
在加压阶段的10秒时间点，在0.11m/s CFV条件下，基于ATF的中空纤维膜内的液流动力学。（a）计算机生成的中空纤维组件的绘图，显示所有CFD模拟中用作计算域的彩色单根纤维。（b）单根中空纤维截面的速度流场。（c）重叠在跨膜压等高线上的膜流速的多个界面（入口、中央和出口）。管腔区和外壳区之间跨膜压差的轴向差异驱动了椋鸟流动现象。
如上图c所示，在施加的条件下，在循环的每个加压和排气阶段，约有一半的膜被用于滤液流出。目前的CFD结果表面，膜利用率在0.11-0.70m/s的进样错流流速值变化范围内以及极低的2 LMH滤液通量下不敏感。但是，其它的CFD模拟（此处数据未显示）显示，一旦滤液通量从2 LMH增加到15 LMH，膜利用率将从50%增加到70%。这可能说明膜利用率取决于进样错流流速和滤液通量的比例。
在这些条件下，TFF中将一直只有一半的膜被利用，而在ATF系统中，双向液流可在单个循环中，实现完整的膜利用。这可能可解释在这些条件下，ATF性能优于TFF的原因。下图所示为在0.11m/s、022m/s和0.7m/s进样错流流速条件下，椋鸟流动的空间和时间分布。尽管在所有条件下，膜利用率相同，但是相比0.22m/s和0.70m/s的进样错流流速，0.11m/s进样错流流速时，入口的局部过膜滤液通量更低。前两者可分别提高~2和~4倍。在每个加压和排气阶段，过膜的总滤液量随进样错流流速增加而增加（表III和下图d），原因是更高的TMP（此处数据未显示）。
在0.11（a）、0.22（b）和0.7(c)m/s的进样错流流速条件下，滤液流速的轴向和时间分布。最高和最低的滤液值分别以红色和蓝色表示。在不同的进样错流流速条件下，膜的单位体积流速与沿管腔的位置相关（d）。在两个阶段，可看到相似的50%膜利用率，且在检测的进样错流流速条件下保持一致。CFD入口边界条件表示为实验获得的流速。入口管腔设置为0[Pa]，出口外壳边界条件设置为0.00255m/s流速，相当于2 LMH。
在不同错流流速条件下，单个循环中，滤液通量的分布。
此前针对微滤系统进行建模的工作主要集中在了解纤维内腔区域的流体动力学。Figuerede-Cardero等使用CFD模型对基于灌流的旋转圆柱形过滤器进行了模拟，并基于过滤器表面的压差推断出椋鸟流动的存在。但是，作者的模型没有包括内腔的多孔区域，所以结果没有显示通量分布。据我们所知，本研究是第一次使用CFD对ATF系统中多孔膜内的椋鸟流动进行了证实和定量。
上清溶液对压力趋势和膜阻力的影响
第29天，离心的CHO细胞培养上清液以0.11-0.70m/s的进样错流流速范围，在ATF系统内循环6小时，以模拟峰蛋白质浓度对ATF性能的影响。计算出口外壳边界区域的CFD模拟滤液压力趋势。下图所示为单个循环中的CFD和实验滤液压力趋势。在0.11、0.22和0.70m/s的进样错流流速条件下，实验和CFD预测值之间的均方根误差（RMSE）分别为0.05、0.10和0.16，说明预测值与实测值良好吻合。
比较在0.11、0.22和0.7m/s的进样错流流速（CFV）条件下，在单个ATF循环中，模拟的上清液滤液压力趋势与实验检测的压力趋势的比较。上清溶液来自灌流细胞培养的最后一天。在操作的最后1小时计算的总阻力用于上清液CFD模拟。滤液流速保持恒定为0.000255m/s，相当于2LMH滤液通量。
为了解上清液性质对不同过滤阻力的影响，使用Darcy公式评估了固有膜阻力（Rm）、总体膜阻力（Rt）、可逆污染阻力（Rrev）以及不可逆污染阻力（Rrev）。如下图所示，洁净膜阻力在所有条件下保持恒定（5.00x 10^10-1）。当膜暴露于0.70m/s进样错流流速时，可逆和不可逆污染膜阻力最高，之后为0.22m/s和0.11m/s进样错流流速。Stressman等使用上清溶液和在恒定通量下进行膜操作的模型，获得了相似的趋势。这些观察结果可能不是直观显在的，因为在膜表面对液体施加高剪切应激可降低滤饼层积聚，这被认为有利于降低膜污染。但是，Taddei等提出，膜上已经存在的物料被压实后，可能对更高的进样错流流速所提供的剪切力的敏感性会降低。此外，Stressman等计算发现，在进样错流流速条件下，起始的污染速率较快，说明进样成分与膜之间的相互作用增加。本研究的CFD结果可能可支持该假设，因为相比平均滤液流速，在高错流流速条件下，滤液外流可提高约4-9倍。
在不同进样错流流速条件下，ATF系统中中空纤维膜的不同过滤阻力的比较。Rm为固有的膜阻力，Rrev为可逆的污染阻力，Rirev为不可逆的污染阻力。相比较低的进样错流流速，更高的进样错流流速可提高Rrev和Rirev阻力。
如之前的研究所示，低细胞培养活性会导致粒径在100nm左右的颗粒增加，其会影响膜的渗透性和产物筛分。这些数据说明，在0.11-0.22 m/s的中等进样错流流速下进行操作，可能可降低滤液流速梯度，且可能可降低100nm左右颗粒导致的膜污染。值得注意的是，在这些模拟中，假设了一个平均总体膜阻力。但是，考虑到滤液流分布存在时间和空间上的变化，污染分布可能也存在变化。
针对进样错流过滤开发的多个经验模型表明，双向液流和/或椋鸟流动可在操作过程中清洁膜表面。但是，我们目前的数据显示，椋鸟流动不会随进样错流流速的增加而降低膜污染。这可能意味着，对于ATF操作，双向液流行为更为重要，其可在单个循环中实现完整的膜利用。
工艺操作条件和生物反应器环境外，中空纤维长度在滤液通量分布中可能也扮演着重要的角色。Binabaji等研究了纤维长度对单克隆抗体溶液超滤的影响。作者发现，压力降会随纤维长度的增加而增加，从而导致反滤增加，以及可获得的抗体最大浓度的降低。这些结果强调了纤维长度对跨膜压降以及相应的滤液通量分布的影响，这对灌流生物反应器中，中空纤维规模放大提出了挑战。总结来说，目前和以往的研究表明，在当前的操作条件下，局部的通量分布可能在膜污染速率中扮演了重要的角色。
总结
研究开发并验证了一种CFD模型，用于描述ATF管腔中复杂的液流。模拟准确显示了使用高渗透性膜的ATF系统中的瞬时液流以及压力趋势，设置与实际灌流工艺中使用的一致。研究确认了之前假定会发生的椋鸟流动现象，并使用CFD模型进行了定量。本文为椋鸟流动以及不同操作条件对局部滤液通量分布的影响提供了数值证据。
获得的结果明确显示，在进样错流流速较高时，由于更高的TMP，组件高压一侧的通量增加。使用水进行的椋鸟液流的CFD模拟显示，在每个加压和排气阶段，约有一半的膜被使用，所以在一个完整循环中，整个膜被使用。CFD模型同时预测了内腔中细胞培养上清液流的通量和压力趋势。膜在高进样错流流速条件下暴露于上清液，与最高的可逆和不可逆污染阻力的形成有关。
这是开发最佳参数设计空间的第一步，包括进样错流流速和TMP。这些初步的CFD结果说明，优化的污染模型需考虑局部通量和阻力分布，以更好地理解不同操作条件对基于ATF的灌流系统中的污染和膜筛分的影响。
原文：F.Radoniqi, H.Zhang, C.L.Bardliving, et al., Computational fluid dynamic (CFD) modeling of alternating tangential flow (ATF) filtration for perfusion cell culture. Biotechnology and Bioengineering, 2018, 115, 11(2751-2759).
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