高浓度制剂中的UF/DF策略
本文节选自来自BMS的研究人员发表的文章“Strategies for high‐concentration drug substance manufacturing to facilitate subcutaneous administration: A review”。由于水平有限，更多详细内容，请参考原文或往期推送针对皮下给药的高浓度药物底物生产策略。
超滤/洗滤（UF/DF）
UF/DF步骤在高浓度药物底物的生产中起着至关重要的作用。这一步位于典型的单抗药物底物纯化工艺的末端，将蛋白质浓缩到其目标值，并将其置换到所需的制剂缓冲液中。达到药物底物制剂的最终赋形剂浓度的目标和/或规格，对于通过匹配生理渗透条件，在保持药物疗效和延长蛋白质保质期的同时，确保患者安全用药至关重要。为了达到这些结果，必须克服高浓度药物底物生产中遇到的几个主要障碍。
UF/DF中的赋形剂漂移
在UF/DF操作中，蛋白质和小分子之间的非特异性相互作用在蛋白质浓度较高时更为明显，并可能导致赋形剂浓度的变化。这使得达到目标制剂条件变得更加困难，因为UF/DF步骤结束时的实际组成在pH和/或溶质浓度方面可能会偏离目标组成。此外，溶质浓度会直接影响溶液的渗透压，这对药品制剂开发至关重要。
对于带电赋形剂，与目标/缓冲液组成的偏差可以部分解释为蛋白质和小分子之间的静电相互作用。由于大分子(单抗)被UF/DF膜截留，在膜的进料侧会形成带电大分子的积聚。这一现象的直观表示如图1a所示。根据Donnan效应，UF/DF膜的滤液侧和截留侧之间必须保持各物质的电中性和化学势平衡。这导致具有与蛋白质相反电荷的溶质在截留液中富集，以及具有与蛋白质相同电荷的溶质的耗尽。随着单抗浓度的增加，这种带电溶质的富集/耗尽变得更加明显。Donnan模型可以用来模拟这种富集/耗尽所导致的pH值变化。
空间限制，如体积排斥，也会导致偏差。在蛋白质浓度较高时，蛋白质分子占溶液总体积的很大一部分。这减少了溶剂和小溶质可用的体积。体积排斥效应的直观表现如图1b所示。在每溶剂质量（molal）的基础上，膜两侧的小溶质的浓度将是相等的。但在摩尔（molar）基础上，分配是不相等的，是蛋白质浓度的线性函数，如下图所示：
图1. 超滤/洗滤(UF/DF)操作过程中赋形剂漂移来源的可视表示。(a)Donnan效应 – 截留单抗和同电荷赋形剂之间的排斥力导致过滤器蛋白质(截留液)一侧的赋形剂耗尽；类似地，带相反电荷的赋形剂将被截留在膜的截留液一侧。(b)体积排斥效应 - 被截留的单抗所排除的体积减少了其它溶质可用的溶液体积，导致溶质在膜的滤液测的分配。
公式中，C为膜截留侧可扩散溶质的摩尔浓度，C’为膜滤液侧可扩散溶质的摩尔浓度，c为蛋白质浓度(质量浓度)，v̅为蛋白质偏微比容。由于大多数蛋白质的偏微比容在0.7- 0.8 ml/g之间，在100 g/L的蛋白质溶液中，蛋白质分子约占溶液总体积的7.5%。由此产生的体积排斥将导致截留侧的溶质摩尔浓度为膜滤液侧摩尔浓度的92.5%。
为了达到目标制剂组成，可以对DF缓冲液和/或UF/DF池稀释缓冲液进行调整，以计入偏差。另外，在UF步骤中，使用高离子强度的缓冲液，可以降低观察到的Donnan效应。
为从经验上考虑赋形剂和/或pH漂移，可以对所需DF缓冲液和目标制剂缓冲液组成的差异进行表征和补偿，如图2所示。可以使用目标制剂缓冲液作为DF缓冲液，进行UF/DF实验。在第二个浓缩阶段(称为“UF2”)采集样品，分析赋形剂浓度和/或pH值。通过拟合数据，确定UF2目标浓度下的排除量。确定一个新的DF缓冲液组成来补偿这个排除量。使用该缓冲液进行UF/DF实验，验证实验结果的正确性。如果结果不满足目标，那么可以使用更高或更低的DF缓冲液赋形剂浓度进行更多的运行。利用这些点，有可能插补所需的赋形剂浓度，以达到目标的最终浓度。这种系统的方法提供了一种UF/DF工艺开发所需的原料量、实验数量和相应的样品分析最小化的方法。该策略可用于确定合适的赋形剂浓度以及DF缓冲液pH值，以达到最终的目标组成。
计算机模型也可以用来预测排除效应。最近，已经开发出了可以密切匹配DF工艺中pH值、缓冲液和赋形剂的模型。通过考虑静电排斥效应和电荷屏蔽，这些模型可以从组成物质的有效pKa值的变化中捕捉缓冲液的非理想性。该模型可以作为工具来设计具有适当缓冲液成分的DF工艺，以满足预期的制剂目标。
在蛋白质浓度较高的情况下，由于成本更高，工艺和批次失败会带来更大的风险。实时分析或过程分析技术可纳入开发和生产过程，以提供更多的工艺理解和/或控制。这些技术包括在线蛋白质浓度检测、实时赋形剂监测或实时杂质监测等。为了将这些技术应用于高浓度的工艺流，需要使用合适的技术来检测未稀释或较少稀释的样品。样品的均质性至关重要，可以通过取样、移液和混合的最佳实践加以控制。在线赋形剂监测可通过在线拉曼光谱或傅里叶变换红外光谱等技术进行，或通过取样和分析方法检测近线进行。
UF/DF中的压力降限制
高单抗浓度下粘度的增加可导致UF/DF中的压力挑战。在UF/ DF过程中，随着单抗浓度的增加，相应的粘度增加会导致膜包轴向压力降的增加。图3a显示了几种单抗的典型粘度与浓度的关系。对于实验室规模UF/DF膜包，这种粘度的增加直接转化为UF/DF系统中压力降的增加，对于中试和大规模膜包尺寸，亦是如此(图3b)。由于跨膜力(TMP；滤液驱动力)与轴向压力降直接相关(TMP= (Pfeed + Pretentate)/2 = Pretentate + (ΔP)/2)，要维持一个恒定的TMP来对抗不断增加的压力降，需要逐步打开夹管阀来降低回流背压。一旦夹管阀完全打开(Pretentate= 0)，进样压力(Pfeed =ΔP)将继续增加，直到达到最大压力限制(取决于设备)，之后必须降低进样流量，以保持进样压力在压力安全限制内。泵所能输送的最小进样流量也可能受到设备的限制。因此，最大压力降和最小可达到的进样流量可以用来确定UF/DF工艺中最大可达到的蛋白质浓度。
除了降低进样流量外，还可以采用其它一些方法来缓解压力降限制。各种赋形剂可以用来降低溶液粘度，在一个案例中已经表明，这将获得更高的膜通量以及更低的轴向压力降。这些赋形剂包括盐和氨基酸，其可以筛选蛋白质电荷和疏水相互作用，以及使吸引力的局部各向异性相互作用最小化。非离子型拥挤剂(如海藻糖)可能提供一种耗尽引力，以渗透性压缩蛋白质，以提高稳定性。研究还调查了pH对分子间相互作用的影响。分子间的相互作用可以用扩散相互作用参数估计。当pH接近抗体等电点(pI)时，这个参数往往是最趋于负值(表示有吸引力的相互作用)，而在远离等电点的条件下则变得更趋于正值。
如上所述，温度与粘度成反比。因此，可以用工艺温度来调节给定TMP下的过滤通量。例如，在高浓度制剂过程中，对于免疫球蛋白G 1 (IgG1)，将UF/DF工艺温度从23℃提高到46°C，可使粘度下降两倍，同时使过滤通量增加两倍，而不影响产物质量。虽然在该研究中没有观察到对产物质量的影响，但升高的温度可能会对其它分子的产物质量产生不利影响。
UF/DF膜包本身的设计也会影响膜包的轴向压力降，最终影响可达到的最高蛋白质浓度。不同的流道、膜包类型、几何结构和筛网都可以发挥作用。开放式流道膜包可提供最低的压力降，但通量也较低，导致工艺时间较长。在典型的UF过程中，会出现浓度极化现象，即截留的溶质在膜壁上累积，形成一层凝胶层。在恒定TMP模式下操作UF工艺时，浓度极化将导致滤液通量下降。
图2. 用于解释UF/DF操作中由于排除效应导致赋形剂和pH漂移的方法。(a) 以目标制剂作为DF缓冲液进行UF/DF实验。pH和赋形剂水平由单抗浓度确定。例子显示的是蔗糖，但方法扩展到其它赋形剂和pH值。(b)拟合数据以确定pH或赋形剂在目标UF2单抗浓度下的排除。(c)用新的DF缓冲液进行实验，确认结果是否符合目标组成。DF，洗滤；UF，超滤。
图3. (a) 对于多种单抗，粘度数据与单抗浓度的关系。(b) UF/DF的压力降与单抗浓度的关系。数据显示为实验室规模(88 cm2)、中试规模(0.11m2)和大型规模(1.14m2)UF/DF膜包。DF，洗滤；mAb，单克隆抗体；UF，超滤。
通过在进样流道中加入筛网，由于筛网起到湍流促进器的作用，并在流道中产生二级液流，因此可降低浓差极化，这在概念上类似于搅拌室的设置，它被证明比开放式流道平行平板切向流过滤装置产生更少的浓差极化。筛网流道可实现更高的通量，从而缩短工艺时间，但也会产生更高的轴向压力降以及更高的膜壁剪切，这会影响产物质量。动态优化的剪切趋势可作为一种缓解策略。在这种方法中，UF浓缩方法通过根据截留液中的蛋白质浓度系统性地改变TMP和错流条件来实现优化。
悬浮筛网的传质系数与中间性筛网的传质系数相当，研究发现，悬浮筛网可在筛网流道的产量和开放流道的低剪切力之间做出折衷。较低的剪切反映在产物质量上，其可以通过可溶性聚体、颗粒形成、流体力学直径以及可滤性来量化。悬浮筛网可使蛋白质浓度达到200g/L或更高，同时最大限度地降低产物质量风险。
中空纤维组件也可以用于缓冲液置换，实现高单抗浓度。由于膜表面没有“搅拌”，中空纤维的通量通常相对较低，因此从稳定性/生产的角度来看，为了使工艺时间合理，必须增大膜的尺寸。不过，此类组件可预灭菌，相比传统的UF/DF膜包可能也更便宜，因此可潜在地抵消所需的更大膜面积的成本。它们产生的轴向压力降也比膜包低得多，这可能可获得更高的最大可实现浓度。在Yehl和Zydney的一项研究中，最初为高通量血液透析设计的单通过切向流过滤组件被应用于生物工艺应用。在此研究中，单根组件即可将IgG处理到200 g/L以上，该组件连续运行120小时以上，而没有膜污染的迹象。
UF/DF中的剪切、聚集
UF/DF步骤被认为是单抗工艺中潜在的聚集来源，特别是当达到高蛋白质浓度时。蛋白质浓度越高，聚集几率越高的风险就越大，因为组成物质的距离越近，分子间的相互作用就越强，自我交联事件的频率也越高。与分子间相互作用有关的其它聚集考量因素将在下面的稳定性部分讨论。由于UF/DF操作本身也有几个因素会导致聚集风险，下文将对此进行讨论。
UF/DF操作可能导致剪切诱导的聚集。膜污染和浓差极化也可促进聚集。在UF/DF诱导的聚集变得显著之前，通常需要高数值的UF/DF泵通过次数（>50），除非蛋白质特别容易发生这种类型的聚集或变性。此外，单抗多次通过泵和节流阀，导致微空化和气泡夹带，导致聚集增加。观察到的聚集可能不是剪切暴露本身直接引起的，而是气液界面或固液界面的界面效应，颗粒污染或泵气穴会加剧这种效应，而其往往与剪切有关。泵的类型也被证明会影响聚集和浊度。与活塞泵相比，蠕动泵的使用可能会增强聚体的形成。
在高浓度药物底物的工艺开发过程中，可以评估UF/DF和其它单元操作过程中剪切的影响。这可以通过在参数操作空间内的最坏情况下(例如，最高负载、最长运行时间、导致泵通过次数最多的条件)进行高剪切单元操作前、后的测试样品进行评估。UF/DF的适当工艺参数的选择也可以通过高通量筛选工具来支持。由于高通量筛选工具通常比传统实验室规模系统对物料的要求更低，它们可以为高浓度的开发工作提供特别的好处，因为开发物料的可用量往往是有限的。此类筛选系统还提供了一个额外优势，即相比使用多个传统实验室规模系统，其设备占地更小。虽然筛选系统的物料需求比传统实验室规模系统低，但其用量仍然不低（例如，0.5-1L），特别是在物料通常非常有限的早期开发阶段，这会造成不小的挑战。一个关键的挑战是可代表大规模条件下通量和轴向压力降的规模缩小膜形式的可用性。虽然筛选研究可以提供一些可放大的膜表征特性(如膜截留或渗透性)的信息，但水动力特性(如剪切率、压力降和传质)会受到边缘效应和边界层形成的影响，这在规模缩小设备中是很难克服的挑战。
可制造性指数已被提出作为预测指标，以根据可制造性对高浓度单抗条件进行排名。该方法用于确定制剂条件，使最终UF/DF步骤的粘度和聚集问题最小化。高通量生物物理筛选数据可用于评估制剂条件(如pH和赋形剂)对溶液粘度和产物稳定性的影响。
收率/残留体积
为了满足更高的物料需求，上游工艺的生产效率越来越高。这些工艺的改进导致了更高的滴度。在某些情况下，为满足需求，可使用更小的生物反应器尺寸以及更小的批次规模，特别是对于高浓度产物。但这增加了对下游工艺的要求，以回收和纯化这些批次的物料。
在许多下游单元操作中，存在系统残留体积，其中包含的物料不容易回收到最终产物池中。总残留体积可能包括来自管道、阀门、泵、UF/DF膜中回流流道等方面的贡献。对于低浓度的产物，相对于产物池的总质量，残留体积中的蛋白质质量可以忽略不计。然而，对于高浓度的产物，残留质量可能占产物总质量的很大一部分。在这些情况下，无法回收残留体积中的物料可能会导致产物收率的重大损失。
在从UF/DF系统中回收物料之前，可以对产物进行低错流、低TMP再循环，使膜表面去极化并混合产物。然后，可对系统和过滤器进行回收冲洗，以从残留体积中回收产物。在理想的塞式液流冲洗条件下，产物回收率应接近100%，产量损失可以忽略不计。然而，在典型的生产环境中，通常会观察到产物的一些稀释。一般来说，一个较大的缓冲液冲洗体积将导致较小的产物收率损失，但更大的稀释。对于具有高蛋白浓度的目标产物，显著稀释的产物池尤其不可取。
UF工艺中产物过浓缩是一种潜在的解决方案，因为在回收冲洗过程中会发生稀释。可以计算TFF池的最小过浓缩，以达到一定的产物回收率，并为TFF生产系统创造操作空间。然而，对于高浓度的产物来说，这可能是一个特别的挑战，因为前文所述的压力降限制可能会限制产物过浓缩的能力。
通过了解系统中的流体动力学知识，可以最大限度地减少稀释。例如，根据管路尺寸和泵的性能，可以在回收步骤中使用较低的缓冲液冲洗流速，以实现低Reynolds数，在层流状态下操作，接近塞式液流。通过限制混合和轴向分散，缓慢的缓冲液冲洗可能有助于将产物移出残留体积，同时使稀释最小化。
在某些情况下，压缩空气吹扫可以有效地将物料推出残留体积。然而，在某些情况下，这是无效的，例如当多个过滤器串联使用，可能导致在第一个过滤器后出现过滤器气锁。空气无法将物料从气锁过滤器的残留体积中逐出。这也可能会导致引入泡沫和产物变性的风险。
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原文：M.Holstein, J.Hung, H.Feroz, et al., Strategies for high‐concentration drug substance manufacturing to facilitate subcutaneous administration: A review. Biotechnology & Bioengineering, 2020, DOI:10.1002/bit.27510.
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