将生物药工艺开发和验证的最佳实践应用于细胞/基因治疗
本文节选自对Orchard Therapeutics细胞和基因治疗技术小组主管Suzanne Aldington的专访，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
问：您现在在做什么?
SA：我目前在领导Orchard Therapeutics的制造科学与技术 (MSAT) 团队，在CDMO处支持慢病毒载体生产。我同时也在支持细胞治疗MSAT团队。
Orchard与许多CDMO合作，因为我们没有自己的生产设施。今年，我们与CDMO合作的一个关键项目是一个后期项目。我们已经生产了用于载体和细胞治疗工艺性能确认(PPQ)批次。这给了我们开发工艺验证方法的机会。
问：您在生物药生物工艺开发方面有丰富的经验 - 在战略层面，您有哪些经验可以应用到您目前在细胞和基因治疗领域的工作中？同样，哪里需要不同的方法？
SA：我拥有CDMO背景，在那里，主要关注于快速开发实验室规模的工艺，并考虑GMP设施：实验室规模的工艺是否适合放大到生产？例如，对于一些非标准的生物药产品，我们必须考虑每个单元操作的性能，例如我们可能使用的层析填料的类型，产品怎么洗脱 - 在工艺开发的早期，就应该问这些问题，比如某种操作在生产环境中是可接受的吗?
工艺开发过程中的关键方面包括定义操作参数和范围，确保这个范围是合适的，并有数据支持。我参与过许多产品的平台工艺，这有助于在不同规模和地点之间，将工艺转换至GMP环境。虽然产品可能不同，但您们遵循的是GMP中相同的一套程序。
采用一次性使用材料在GMP环境中也是非常有益的。在我之前参与的一些工艺中，细胞扩增和纯化阶段的持续时间可能会很长。GMP操作转向一次性使用材料，可以减少非增值性工作，并提高产能。例如，使用预装层析柱可以消除在工厂运行时间内进行装柱的要求；使用200L和500L袋子替代不锈钢罐，则无需以经过验证的方法进行设备清洗；部件以无菌形式提供，因此降低了对可高压灭菌材料的要求。然而，随着一次性使用材料的增加，也会有不同的风险，比如了解进入工艺流的溶出性和析出性风险至关重要。
一次性使用技术还有助于改善工艺中的微生物控制，因为可实现更封闭的工艺，且仅需要更少的手工操作。我们一直在关注降低生产过程中的开放式操作，而不仅是在工艺开发当中。在较小的规模条件下，您可以尝试尽可能地模拟GMP工艺，但对于封闭式工艺，选择更有限，所以关键是尽可能地减少人工操作以及开放式工艺。
原材料的质量 (如化学品)是另一个重要方面，确保工艺开发中使用的化学品适合GMP使用，并且与GMP生产中使用的化学品具有相同的等级和质量。材料等级的差异会影响工艺性能。
在工艺开发过程中，您需要总是把产品的质量作为重点。了解杂质清除总是至关重要的，以表明您的工艺可清除来自培养 (例如来自宿主细胞) 的杂质。使用平台工艺可以增强这方面的知识。
所以，这些是在开发一般生物药工艺中需要考虑的一些方面，当然，这些考量也适用于细胞和基因治疗领域。特别是，开发一个平台化方法，且其具有明确的操作范围和经过验证的可接受范围，确实有助于工艺理解以及工艺转换到GMP生产当中。
从我的经验来看，两者之间有很多不同之处，首先让我震惊的是规模。我习惯了从10L的实验室规模生物反应器放大到1,000L – 20,000 L的生产规模生物反应器。然而，在Orchard，我们正在使用自体细胞疗法，针对患者群体极小的罕见疾病展开研究，因此，生产规模要小得多。在这些工艺中使用的细胞类型是不同的，如载体生产中使用的贴壁细胞，其使用不同的技术或适应技术进行扩增。此外，载体工艺是细胞扩增的规模扩展和纯化过程的规模放大的组合。
对于自体细胞疗法，药物产品的体积非常小，因此必须考虑过程取样的影响。然而，您确实需要足够的过程中和最终产品样品，以证明您们的工艺是稳健的，杂质清除水平是可接受的，最终产品符合放行规范。产品放行需要进行大量的检测，这与生物药放行检测的范围没有太大的区别。分析方法显示了所需检测类型的许多相似之处(例如对于纯度、DNA、宿主细胞蛋白以及外观等)，但增加了复杂性(比如质粒DNA的存在)以及潜在的更多变异性(例如载体滴度检测)。对于生物药而言，一旦药品符合放行标准，则可将其保存较长时间，而对于细胞疗法而言，则应尽快给患者用药。
过去，当我在工艺性能确认批次生产前进行工艺表征研究时，过程中材料是从具有代表性的GMP批次中提取的，以用于实验室规模的实验。这在载体工艺中仍然是可能的，但您不能在依赖患者物料的细胞治疗工艺中做到这一点。因此，必须使用健康供体物料来表征细胞工艺，这本身就是一个限制，因为健康供体物料的来源有限。诸如此类的挑战表明，细胞和基因疗法可能比生物药产品经历更少的工艺表征。但是，如果您有一个平台工艺，当您使用同一个平台生产更多产品时，您将构建针对该平台的知识，并帮助确保您的工艺表征尽可能集中和稳健。
问：鉴别、监测和记录关键质量属性 (CQA) 随着细胞和基因治疗领域的逐步成熟，已经成为一个巨大的关注点，您能告诉我们在这个特定的区域，您使用的方法吗，比如您已经能够应用的、来自生物药领域的具体知识?
SA：我发现这对细胞和基因治疗领域来说是一个有趣的挑战。无论您是在处理基于抗体的产品还是细胞和基因治疗产品，我认为CQA总是关于您所不知道的东西。目前已经有一些很好的指南，可用于评估单克隆抗体的CQA，对这些产品有相当多的“一般”知识。
细胞疗法的情况非常不同。我们的产品包括转导的干细胞。对于一个生物系统来说，有很大的可变性，尤其是因为在进行临床试验时，我们使用的是来自患者的起始材料。再加上我们所做的工作是针对非常小的患者群体的，这对于鉴别关键质量属性来说将更有挑战性，因为这将需要更长的时间来建立数据包。
我认为生物药领域的风险评估方法对CGT很有用，这也是我们在载体CQA和细胞工艺CQA中所使用的。例如，我们一直在考虑如何给安全性和有效性打分和排名。有一些更明显的属性，如细胞活性，但我确实觉得有许多未知的CQA，特别是对于细胞，免疫表型。为了应对这种情况，我们正在建立更多的免疫表型知识，并试图与临床数据建立更强的联系 - 例如，通过鉴别任何可能改善移植的细胞特征。不过，这可能需要更长期的数据。就目前而言，这仍然是一个巨大的学习领域。
问：工艺验证是一个相对热门的话题，随着越来越多的CGT公司需要进行相关的工作，而使该议题日益突出。目前CGT产品的工艺验证是什么样子的，存在什么问题，在这方面，它与蛋白质治疗领域有什么不同?
SA：同样，与CQA一样，我认为您可以使用相同的方法对载体和细胞治疗生产工艺进行风险评估 – 您可以使用失败模型和影响分析(FMEA)工具来鉴别潜在的关键工艺参数，这可以帮助识别数据或信息中的任何差距，以支持您的操作范围。这反过来可以帮助您确定进一步的工艺表征研究。对我来说，这一直是进入PPQ(工艺性能确认)批次之前的基础，无论哪种生物制品形式。
在细胞疗法中，您确实有使用健康供体起始物料生产PPQ批次的问题。在随后的某一时刻，您必须将该数据与您的GMP临床批数据进行匹配。因此，您需要使用健康供体细胞生成一个规模缩小模型，并与使用健康供体细胞和患者细胞的GMP性能进行比较。从一开始就了解患者的物料和健康供体物料之间的区别是很关键的。例如，健康供体会有功能良好的基因，该基因将能够表达患者体内缺失或表达不良的蛋白质或酶。问题是，您如何弥补这一差距，以显示可比性?
对于CGT，您仍将执行相同的工艺验证程序。您将制定工艺验证主计划、PPQ方案 (包含已确定的CPP (关键工艺参数))、含接受标准的过程中检测、证明微生物控制，并发布PPQ报告。您需要证明您有一个稳健的工艺，理解操作范围，以满足所需的产品质量。您将在整个工艺过程中执行标准杂质检测，以了解您的工艺清除杂质的情况。对于病毒载体生产，目的是产生杂质含量极低的载体产品，以最大限度地减少对细胞工艺和药物产品的影响。这与生物药的药物底物生产类似。然而，会有额外的杂质被引入到细胞工艺中，这需要监测。与载体工艺相比，细胞工艺需要使用不同的工艺步骤，以确保杂质去除 - 例如，通过细胞漂洗步骤。杂质分析提供了一个潜在的证实过程，即PPQ中工艺是多么稳健。
最后，PPQ批次后持续的工艺验证对于确保您有一个良好的程序来持续跟踪和监控后续批次非常重要，特别是当您使用相当小的患者批次数据包时。
问：在工艺开发的早期阶段为工作验证做准备时，有哪些关键的考量因素? 您可以分享些最佳实践吗，来帮助早期CGT开发人员在今后避免“陷阱”？
SA：对我来说，在开发实验室规模的工艺时，总是要考虑将来的GMP工艺。试想一下，如果一切顺利，您最终将以什么样的规模进行生产，因为无论您是要规模放大还是规模扩展，您都将需要一个稳健且直接的工艺，以符合GMP的要求。
正如我之前所说的，我推荐平台方法。您可能会将平台工艺用于针对少数患者的数量较少的产品，但每次运行该平台工艺时，您都在构建有价值的知识和理解。这将简化工艺向GMP的转移，帮助您建立和巩固操作参数和范围，让您更好地了解对产品纯度和杂质清除的影响。
如果可以，建立一些经过验证的可接受范围，比您的正常操作范围更宽。但是一定要有一个您可以工作的范围，因为这是GMP所要求的，而不是设定值。
要清楚您的质量属性是什么，因为这些是确定工艺验证的关键工艺参数的核心。当您建立参数的操作范围时，可以评估其对CQA的任何影响，这将有助于未来的工艺表征工作。
确保一切都有良好的文档记录 - 例如，操作范围是如何定义的，什么时候实验没有按照预期进行，以及任何值得注意的观察结果 (例如过滤某种物质有多容易或多困难)。在开发报告中详细描述细节总是好的，这样您就有了一个参考文档。文档和可追溯性对于工艺验证尤其重要，在进行工艺开发时需要记住这一点。
尽可能多地考虑使用封闭系统。当然，在实验室条件下很难做到这一点，因为你处理的体积很小 - 例如，您可能会使用烧瓶而不是袋子来处理过程中的材料。但是当您在开发一个工艺时，尽量使用与GMP环境相同的设备。
问：与生物药领域的技术相比，CGT生产的赋能技术工具箱显然仍处于开发当中。您认为对创新技术最迫切的需求是什么?
SA：我认为尽可能地封闭和自动化细胞治疗工艺是减少手工操作、优化GMP工艺中微生物控制的关键。我想强调的另一个紧迫领域是分析方法。尽量缩短产品放行的时间是可取的，因为即使您有方法可以冷冻保存您的细胞，您也会希望尽可能快地给病人使用。目前，许多分析方法需要相当长的时间，并可能产生很高的可变性。您能在24小时内完成所有的放行检测吗? 这将是最为理想的一种情况……但目前，我们还没有达到这种程度，即使对于生物药来说，也没有实现。
问：一个相关的话题，虽然许多人呼吁为CGT生产定制更多的工具，但是，是否仍然有机会利用传统生物药技术或生物工艺技术，这些技术是否尚未被充分探索用于CGT?
SA：当我第一次开始研究慢病毒载体工艺时，我想到了一件很明显的事情，那就是需要一种良好的亲和层析填料。如果您想想抗体领域，基于ProteinA的填料改变了抗体的生产过程 - 突然之间，您可以在下游工艺的第一步就获得高纯度的产品，且保证良好的收率。我知道有一些可用于AAV的亲和填料，但如果有用于慢病毒载体的填料将会有很大的不同。
问：最后，您2021年的工作重点是什么?
SA：我们想要做的关键事情之一是开发、记录和建立Orchard的工艺验证方法。
我们今年进行的工艺验证工作是我们Orchard第一次取得“所有权”：我们的罕见疾病产品组合是从GSK那里收购的，GSK此前也曾自行进行工艺验证。我们将专注于明确方法，我们的策略，确保程序到位 - 这关于标准化和模板，特别是在我们有平台工艺的地方。
随后，我们可能会与不同的CDMO合作来实际实现这些工艺。不同的CDMO可能有不同的方法，所以我们需要确保我们能保持一致。
另一个优先考虑的领域是改进我们的数据分析和趋势分析方法。我们从我们的批次生产中生成了大量的数据 - 我们将专注于努力改进我们如何整理数据，如何对数据进行趋势分析，以及如何监控GMP批次，无论是临床还是商业批次。
原文：S.Aldington, Redeploying biopharma process development and validation best practices for cell and gene therapy. Cell & Gene Therapy Insights 2020; 6(11), 1587–1594.
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