针对吸入式mRNA递送的脂质纳米颗粒
本文节选自《Lipid nanoparticles for the inhalation of mRNA》，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
脂质纳米颗粒可经优化后用于mRNA的有效雾化递送。
现在清楚的是，由脂质纳米颗粒(LNP)递送的编码严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)刺突蛋白的信使RNA (mRNA)能够有效地保护肺部免受病毒感染。一般而言，mRNA疗法还可用于治疗或预防囊性纤维化、肺癌、哮喘等肺部疾病。LNP包封mRNA可提供核酸保护，防止核糖核酸酶降解，促进其被细胞摄取，且大部分是非免疫原性的，并允许实现被包封治疗药物的控制释放。让LNP包封的mRNA进入肺部的最直接(可能也是最安全、最有效的)途径是吸入，因为它能最大限度地提高这些器官中的治疗浓度，并限制其系统性暴露。James Dahlman、Philip Santangelo和他们的同事在《Nature Biomedical Engineering》上发表的文章描述了一种优化LNP的筛选方法，使得mRNA可以以雾化气溶胶的形式递送到肺部。
Dahlman和合作者通过分析不同化学成分和纳米颗粒组分 (主要脂质、中性或阳离子辅助脂质以及聚乙二醇)摩尔比对mRNA雾化递送至小鼠肺部的影响，采用基于聚类的方法来制备LNP。研究人员以微流控的方式生产LNP，并使用先前优化的低聚-脂质偶联物(称为7C1)作为主要脂质，以及编码纳米荧光素酶的mRNA。他们在LNP通过针对动物鼻部设计的暴露舱递送到小鼠肺部48h后，通过定量发光，对体内直径小于200nm的单分散LNP进行了检测 (需要指出的是，仅鼻部吸入腔的递送效率很低，只有约1.4%的雾化量可有效吸入；因此，它们需要大量的雾化物料)。第一轮筛选涉及产生6种“极端组”LNP：高摩尔分数的中性脂质、7C1和中性脂质、7C1和胆固醇、阳离子辅助脂质、PEG或7C1和PEG。由于高辅助性中性脂质或胆固醇含量的LNP的PEG和(非辅助性)脂质含量较低，结构不稳定，表明PEG和主要脂质的存在对于生产稳定的、基于7C1的LNP至关重要。具有较高PEG和阳离子辅助脂质比例的LNP分别会导致小鼠肺部最高和第二高水平的发光。为了对LNP配方进行优化，作者测试了含有不同摩尔比的阳离子和中性辅助脂质、胆固醇、7C1和PEG的配方。对于用阳离子辅助脂质配制的LNP，LNP的粒径取决于PEG-脂质的含量，当PEG的摩尔分数较低时，形成的LNP更大。当通过吸入给药给动物时，PEG含量较高的LNP比PEG摩尔分数低的LNP发光更大，这证实了PEG是高效体内mRNA递送的关键辅料。对于使用中性脂质配制的LNP，作者测试了使用两种聚合物长度(14或18个碳原子链)、胆固醇和7C1的PEG-脂质偶联物配制的LNP。同样，LNP粒径取决于PEG-脂质偶联物的摩尔分数。在含有低摩尔分数PEG的LNP以及使用更长聚合物的LNP中观察到了更高的荧光素酶表达。根据收集到的所有数据，作者得出了三个设计规则：PEG-脂质偶联物的存在对于形成稳定LNP至关重要，雾化mRNA递送可以通过阳离子辅助脂质和更高摩尔分数的PEG的使用而优化，使用阳离子辅助脂质的配方比使用中性脂质的配方需要更多的PEG。
图1：用于优化包封mRNA的LNP的基于聚类的方法。
a. LNP雾化配方的多维设计空间可以通过“化学特征”(如图所示)来定义，例如阳离子辅助脂质的摩尔分数或PEG -脂质偶联物的结构，可通过首先表征空间“极端”处LNP配方组合(用彩色圆圈表示)在体内的稳定性和递送效率(通过检测吸入了包封编码纳米荧光素酶的mRNA的LNP的小鼠的肺部发光水平)而有效地探索。b，然后，有希望的“极端”配方在其化学空间附近“扩展”，并对其进行表征，这为后续的优化步骤提供了信息。
Dahlman和同事优化的LNP组成包括7C1、胆固醇、14碳原子PEG和辅助脂质DOTAP(1,2-二油酰-3-三甲基氨-丙烷)，其摩尔分数分别为35%、5%、55%和5%。与用于系统性递送的LNP相比，优化后的LNP在雾化后表现出更高的结构稳定性，在小鼠肺中的发光也明显更高。此外，优化后的LNP大部分均匀分布在治疗小鼠的肺组织中，并优先在肺泡间隙积聚。研究人员还表明，mRNA可以在肺上皮细胞(纤毛和支气管)以及肺泡I型和II型细胞中检测到，治疗的小鼠没有经历任何不良事件，而且在肺以外的器官中无法检测到mRNA的表达。在暴露后7天内仍可检测到发光，在雾化递送后2天检测到肺部的发光水平最高。此外，他们的结果表明，在动物接种致命剂量的甲型流感病毒前几天，将包封了编码广泛中和抗体的mRNA的LNP通过吸入递送给小鼠，可保护所有动物免于死亡。
分散到可吸入气溶胶液滴中的纳米颗粒会受到剪切应力的影响，这可能导致颗粒破碎，影响有效载荷的稳定性，特别是对mRNA等亲水分子而言。虽然通过适当的配方设计，雾化LNP可以保持其粒径和电荷，但mRNA的包封效率会显著下降(从高于80%降至约40%)。Dahlman和同事使用的振动筛网雾化器(图2)通过带有微米孔径的穿孔板产生气溶胶，振动频率为~100kHz，这对于LNP来说，比喷射和超声系统更温和。然而，振动筛网雾化器通常会导致LNP的检测粒径增大，这可能反映在LNP的结构损伤上。更大网孔的雾化器可最大限度地减少LNP的破坏，并提高其有效载荷的保留；然而，更大的筛网孔径意味着更大的液滴尺寸，导致可吸入的细微液滴密度降低。依靠表面声波的新型雾化器不受这些问题的影响。
图2. 震动筛网雾化器会影响LNP配方的特性
该装置的设计会影响纳米颗粒的结构和物理化学稳定性，从而影响封装的有效载荷 (红色)、纳米颗粒的平均粒径和它们的粒径分布、以及有效载荷的包封效率。
Dahlman和合作者的LNP设计方法原则上适用于其它类型RNA和核酸的递送，也适用于配方成可吸入干粉的LNP。随着基因疗法进入临床，通过吸入雾化或粉状配方对肺部进行局部治疗的策略对呼吸系统疾病的治疗将变得越来越重要。当然，针对系统性递送而开发的配方不能简单地用于吸入，而针对吸入而开发的配方也受到其自身稳定性、制造、规模放大和长期存储的挑战，还需要大量的优化工作。
原文：R.Y.K.Chang, H.K.Chan, Lipid nanoparticles for the inhalation of mRNA. Nature Biomedical Engineering. 2021, https://doi.org/10.1038/s41551-021-00794-x.
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