个性化药物：从细胞系制备到生产的工艺步骤
本文节选自《Process Steps from Cell-Line Preparation to Manufacture of Personalized Medicines》，详细内容，请参考原文。
所有获得上市许可的药品都必须遵守GMP。同样，临床试验药品的生产也必须符合GMP。根据2001/83/EC1指令第3(7)条，给予患者的高端治疗药品(所谓的“医院豁免”)必须按照与生产具有市场许可的高端治疗药品相同的质量标准生产。
正如再生医学联盟（Alliance of Regenerative Medicine）全球行业报告所总结的那样：
据估计，全世界有3亿人患有罕见疾病。
目前有647个利用再生药物进行的临床试验。
全球有400多家公司积极开发再生药物和罕见疾病的高端疗法。
2019年，为罕见疾病开发再生药物的公司在全球融资总额超过60亿美元。
价值传播 - 药物开发空间
除了验证，适用性域(Applicability Domain；AD)的概念可能是决定已建立的定量构效关系(quantitative structure– activity relationship；QSAR)模型的质量和可靠性的最重要方面之一。各种AD估计方法已被设计出来，可应用于特定类型的QSAR模型，它们的实际应用在文献中得到了广泛的介绍；图1和图2描述了价值的传播。
开始细胞生产和构建细胞系为主和工作细胞库
高端治疗药物(ATMP)的起始物料包括供体选择和筛选、采购、加工、免疫匹配以及细胞和组织移植中的临床移植，以及制药和生物技术行业中的制造水平。这些治疗方法从最低限度操纵的自体产物到由相当复杂的多能干细胞衍生的潜在大规模异体产物，各不相同。它们理应受到严格的监管控制。
根据它们的分类，它们可能处于一个或多个血液、组织、细胞或药物的立法和它们批准的指导文件之下。然而，除了强制性要求之外，还有许多悬而未决的问题。对捐赠者进行传染性病原体和基因异常筛查的程度、知情同意的性质和程度以及如果发现与捐赠者的健康、家庭或公共健康有关的结果时对捐赠者的照顾义务。还有与制造过程本身相关的风险，细胞产物的特性及其在受体后管理中的行为。与细胞疗法相关的内源性风险，特别是关于供者选择、同意和测试，并提出如何优化这些的建议，以支持细胞疗法的发展，最大限度地提高供者和患者的安全性。管理细胞治疗感染的可能性仍然是潜在受者的最大风险之一。大多数感染因子会对细胞系产生细胞病变作用，并通过强制性产品(质量控制)检测来检测它们的存在，从而在使用前将细胞丢弃。有一些潜在的，可能是一些未知的病原体，它们可能会与细胞结合，形成持续的，但不明显的感染。这些感染因子可能来自供体细胞本身，在收获时或在增殖过程中受到污染。
在获取起始细胞作为加工和生产医药产品的自体起始细胞系时，有两种设想/使用的选择;
以患者自身细胞为起始物料，见图3。
兼容(患者除外)细胞作为起始物料的使用，图4。
什么是转染?如何转染细胞
转染是目的性地将裸露的或纯化的核酸引入真核细胞的过程。它包括将DNA、RNA或蛋白质引入真核细胞，并用于研究和调节基因表达。
转染技术作为一种分析性工具，促进遗传功能、蛋白质合成、细胞生长和发育的表征。转染试验促进了细胞研究，从而提高了药物发现策略。策略如病毒转染或病毒转导，利用，例如，慢病毒(见表1)颗粒将外来物质插入到真核细胞中。
转染的类型
有很多的转染方法正在被使用，包括物理，化学和生物技术。这些技术通常包括使用瞬时或稳定的转染方法，使核酸进入细胞。
瞬时转染技术包括将DNA导入细胞，但在这种方法中，DNA不与细胞染色体整合。这种技术促进了高转染效率，基因转录本可以在一到四天后分析。对于哺乳动物细胞培养中的大规模瞬时基因表达(TGE)，可以使用诸如聚乙烯亚胺(PEI)和磷酸钙(CaPi)等转染试剂。在无血清的情况下，利用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞建立了大规模的TGE方法。
一些常用的转染技术包括磷酸钙沉淀、脂质转染、电穿孔和病毒转染。这些技术包括将两种不同的核酸同时输送到同一细胞中，通常用于实现稳定的转染。转染方法已经发展到包括几种新的方法，如利用高速微粒将核酸传递到细胞的生物递送系统，以及促进siRNA分子系统递送的体内转染方案。
病毒转染
这种方法使用病毒载体将核酸输送到细胞中。病毒递送系统，如慢病毒，腺病毒和逆转录病毒载体，可以用于转移核酸，甚至进入难以转染的细胞。
尽管病毒递送方法非常有效，但它们可能相当费力。大多数病毒需要控制和仔细监测生物安全水平。在进行病毒转染之前，考虑几个限制因素也很重要，如病毒载体的裂细胞性质、细胞系包装和宿主细胞特异性。
mRNA转染工艺
mRNA转染工艺比较简单：mRNA直接在细胞质中传递和表达，因此不需要穿过核膜。递送后，它能立即转化为细胞质中的蛋白质。
因为这个基因表达方法不需要mRNA分子进入细胞核，所以是一种理想的解决方案，用于转染干细胞、神经元、淋巴瘤和更多难以转染的细胞类型(图5)。对于一些应用，mRNA转染的瞬态特性是所需要的，包括细胞重新编辑、基因组编辑(CRISPR/Cas9)和疫苗。
mRNA转染的优势：mRNA转染比DNA转染有一些独特的优势，这在基因编辑研究中对难以转染的细胞类型特别有帮助：
对于难以转染的细胞类型，mRNA的转染效率更高(>80%)。
mRNA转染可形成更快速的蛋白质表达，因为它不需要先转录。
蛋白质表达很容易通过改变mRNA浓度或转染重复来调节。
mRNA转染不需要进入细胞核，因此非常适合非分裂细胞。
无插入突变风险，因此转染细胞无基因组修饰。
转导工艺
转导是指外源DNA被病毒或病毒载体引入细胞的过程，例如，病毒将DNA从一个细菌转移到另一个，这就是水平基因转移的例子。转导不需要“捐献”DNA的细胞和接受DNA的细胞之间的物理接触，而且它是耐DNA酶的(转化对DNA酶-Dnase-敏感)。转导是分子生物学家用来稳定地将外源基因引入宿主细胞基因组(细菌和哺乳动物细胞)的常用工具，见图6所示示意图。
注意：脱氧核糖核酸酶(简称Dnase)是一种催化DNA主链上磷酸二酯键水解的酶，从而降解DNA。脱氧核糖核酸酶是一种核酸酶，是能够水解连接核苷酸的磷酸二酯键的酶的总称。
转导的类型
转导有三种形式：
一般转导：发生在噬菌体的裂解循环中。噬菌体的DNA进入大肠杆菌。这个DNA复制并产生许多新的DNA和衣壳。细菌的DNA被破坏了。一些DNA片段也进入噬菌体病毒的衣壳。细菌破裂并释放出新的噬菌体病毒。现在噬菌体进入受体细菌并将供体细菌的DNA转移到受体细菌的DNA中。细菌的内切酶能破坏噬菌体病毒。这些细菌吸收了供体细菌的基因并进行复制。
特异性转导：发生在噬菌体病毒的溶原性循环中。在这个循环中，病毒DNA作为噬菌体并入细菌DNA。那里仍然是和平的。但有时，它会溶解。它来自细菌DNA。细菌DNA的某些部分仍然附着在上面。病毒DNA与细菌DNA片段一起复制并脱落新的衣壳。细菌破裂。病毒感染其它细菌，并将供体细菌的基因转移到受体细菌上。
限制性转导：某些噬菌体进行一种限制性更强的转导。它们只携带细菌遗传物质的特定部分。它们只转导少数基因。逆转录病毒进行特异性或限制性转导。这些病毒能在动物体内引起肿瘤的形成。现在我们知道，这些病毒用它们基因组的一小部分交换一个在基因调控或复制中起作用的突变细胞基因。这些携带突变基因的病毒会感染细胞。它们将这些细胞转化为肿瘤细胞。
细菌转化
什么是细菌转化?细菌转化是细菌从环境中吸收外源遗传物质(裸DNA)的水平基因转移过程。Griffith于1928年首次报导了肺炎链球菌中的这种现象，Avery等在1944年证实了转化原理。
通过转化的基因递送过程不需要活体供体细胞，而只需要环境中存在持久的DNA。细菌进行转化的先决条件是它能够吸收游离的细胞外遗传物质。这种细菌称为感受态细胞。
转化因子(DNA)一旦进入细胞质，如果与细菌的DNA不同，就可能被核酸酶降解。如果外源遗传物质与细菌DNA相似，它可能整合到染色体中。有时外源性遗传物质可能以质粒形式和染色体DNA共存。
转化的原因
自然转化现象使细菌种群克服了种群动态的巨大波动，克服了在恶劣和极端环境变化中维持种群数量的挑战。在这样的条件下，一些细菌会自发地从细胞中释放DNA到环境中以供感受态细胞吸收。感受态细胞也对环境的变化作出反应，并通过自然转化过程控制基因获取水平。
细菌的感受态
并不是所有的细菌都能从环境中吸收外源DNA。获得感受态细胞的实际方法是使用化学物质或电脉冲使细菌细胞具有人工感受态。
化学诱导感受态包括以下步骤：
在磷酸钙存在的情况下对细胞进行冷却，使其具有渗透性
与DNA一起孵育
在42°C条件下热休克处理60-120秒，使DNA进入细胞。要忍受热休克治疗，重要的是所用的细胞处于生长的对数期
另一种方法是让细菌细胞通过电脉冲渗透，这个过程被称为电穿孔。
转化的应用是什么?
转化现象已广泛应用于分子生物学领域。由于易大量生长，转化细菌可作为宿主细胞用于以下用途：
制备DNA拷贝
用在克隆过程中
表达大量的蛋白质和酶
cDNA文库的生成
用于DNA链接研究
一个典型的转化反应需要什么?
感受态细胞
超螺旋质粒DNA
转化介质
选择性标记(抗生素和/或显色底物)
转化效率定义为转化反应中每微克超螺旋质粒DNA产生的转化子数。
文章来源：https://www.americanpharmaceuticalreview.com/
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