在 GMP 环境中mAb 生产向连续工艺转变的原则 - 从批次向连续过渡的一步
来自瑞士Merck KGaA的研究人员在2022年4月的《Biotechnology Progress》杂志上发表了题为“Transfer of continuous manufacturing process principles for mAb production in a GMP environment: A step in the transition from batch to continuous”的文章。文中，研究人员指出，实施连续工艺代替批次上游工艺 (USP) 和下游工艺 (DSP) 来生产重组治疗性蛋白是一个重大的模式变化。文章介绍了如何使用最初为批次操作而设计的设备，以连续的生产工艺和原则，来生产第一公斤的单克隆抗体。交付临床物料的项目时间线推动了这一雄心并帮助了过渡。然而，由于设备的可用性，必须在设想的连续下游工艺 (cDSP) 操作和文章中描述的操作之间进行权衡。在研究中，以两次 GMP 运行共生产了 2.1 kg 的mAb用于临床试验。对于 USP，升级了 200 L一次性中试规模生物反应器，以实现灌流操作。DSP 步骤被设计为可以轻松转移到 cDSP，以用于今后的临床或商业化生产。以不连续的方式测试了在线调节缓冲液制备策略，以证明其效率，并构建了与含有抗体的细胞培养上清液的连续收集并行的级联纯化结构。该策略将避免在以后转移到目前正在进行质量确认的连续设备时所需的任何工艺更改。小规模参考运行与 GMP 运行在生产力和质量方面的一致性证实了所提出的方法是有效的。因此，研究人员认为，现有的补料分批基础设施可以适应连续生产，而无需大量额外的投资。这种方法有助于在进行大量投资之前评估下一代生产工艺。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
由于为了保证最终产品的有效性和安全性的复杂监管环境，接受和实施用于生产生物治疗药物的新技术是漫长而具有挑战性的。Merck KGaA 医疗健康部门的目标是到 2022 年针对USP 和 DSP 实施连续技术，用于重组治疗蛋白的临床以及随后的商业化生产。从批次转向连续操作是一种模式的变化，它会影响工艺、控制策略、设备、工厂占地面积、质量监控以及监管等各个方面。连续生产从本质上实现了工艺强化，这可转化为更小的工厂占地面积以及其它众多优势，包括更低的资本支出、更短的建厂交付时间以及更大的灵活性。连续纯化技术影响生产力和占地。例如，连续层析可减少填料和缓冲液的消耗以及废物的产生。Yang 等人发表了一篇侧重于经济评估的文章，通过不同方式比较了基于不同方法的批次和连续生产。已经有诸多小规模的研究报告了连续工艺的可行性和优势。本文将介绍在默克公司，如何在现有的补料分批车间中，使用旨在适应未来连续生产平台的工艺，生产用于 1 期临床试验的新生物药的前两个 GMP 批次。据我们所知，到目前为止，还没有关于在这种规模的临床或商业化生产中实施包括灌流 USP 和 cDSP 在内的连续生产的报告。不过，Coolbaugh 等人于2021年报告了使用 100 L 灌流生物反应器和 cDSP 步骤的成功中试规模概念验证。数十年来，灌流一直用于治疗性蛋白质的生产，以往主要用于不稳定分子。行业向连续工艺发展的总体趋势以及细胞系、培养基和截留技术的改进使得现在能够用悬浮细胞进行灌流细胞培养。
在本项工作中，USP 在一次性 (SU) 补料分批生物反应器中以 200 L规模运行。该罐通过一些额外的设备进行了升级，包括电容探针、泵、天平、流量计以及使用交替式切向流过滤 (ATF) 的细胞截留装置 (CRD)。这些辅助设备用于操作和控制培养基进料 (M)、废弃 (B) 和收获 (H) 流速。无需任何修改即可使用 DSP 设备，但以特定方式操作，下文将对此进行说明。
对临床物料的需求是由项目时间表所驱动的。对于本研究中描述的单克隆抗体 (mAb)，从项目一开始就冒着风险为 USP 和 DSP 设计了一个连续的工艺。团队为 USP 和 DSP 实施了新的开发实践。这一决定的一个挑战是 cDSP 设备仍处于调试阶段，因此不适用于 GMP 操作，而此时需要第一批物料进行首次人体研究。作为替代方案，为了处理灌流设置产生的大量收获液，设计了并行批次 DSP 操作。经过四天的灌流，合并的收获液以批次模式捕获并进一步处理（参见图 1A），但其中包含了 cDSP 原理。所有与 cDSP 兼容的工艺参数都通过并行化操作和合并策略进行了考量（参见图 1 和表 1）。不同的DSP处理步骤包括捕获（CAP）、病毒灭活（VI）、深层过滤（F）、阴离子交换精纯（AEX）、混合模式精纯（MM）、纳滤（NAF）、超滤（UF）/洗滤（ DF) 以及制剂成药物底物 (DS)。结合-洗脱 (BE) 层析用于捕获，而流穿 (FT) 操作用于两个精纯步骤（AEX 和 MM）。该实践的主要目标是实施一个可以轻松适应未来 2000-L 连续生产平台的工艺（参见图 1B），而不会引入重大工艺变更，也不会影响产品质量、杂质清除或产量。本文介绍了如何成功应用该策略在第一次 GMP 运行 (GMP1) 中纯化多达1.2 kg 的蛋白质，以及在第二次运行 (GMP2) 中纯化多达 0.9 kg 的蛋白质，总产量为 2.1 kg。同时，GMP 运行与用于验证工艺可再现性的小规模参考运行进行了比较。
除了这些工艺操作之外，还引入了创新的缓冲液管理系统。该平台称为缓冲液混合平台，基于3种母液（酸、碱、盐）。母液自动与不同比例的水混合，以产生 cDSP 链所需的各种缓冲液。下游缓冲液通常涵盖广泛的 pH 值、电导率和化学物质浓度。为了满足这种需要，设计了一种具有多种 pKa 的不同化学物质的酸性浓缩母液。NaOH 溶液用于滴定 pH，而NaCl 溶液用于控制缓冲液电导率 (CT)。在线缓冲液调节设备最终将能够在线稀释这些母液和水，以按需生产适当的缓冲液。这种策略可以将缓冲液存储空间减少约 10 倍，因为它们以浓缩配方存储。在目前的研究中，如果没有 cDSP 设备，就不能使用在线调节。相反，使用三种母液离线制备缓冲液。因此可以测试平台效率。剩下的步骤将是大规模实施在线稀释能力。
当前和目标工艺流程调度。
灌流生物反应器操作
参考运行
运行六个参考生物反应器（3.5 L）以评估该工艺的可重现性。灌流生物反应器 (Biostat BDCU，Sartorius Stedim) 以 0.5 x 106 cells/mL 的密度接种。细胞培养维持温度 36.5°C，溶氧 (DO) 设定点为50%。在生长阶段结束时，一旦达到目标生物量（对应于 30 x 106 cells/mL），将温度降至 33°C。使用 CO2 或 1.1 M Na2CO3 将 pH 值控制在 6.90 - 7.24。培养物的工作体积为 2 L。在第 2 天开始灌流，并设置为每天 0.5 个罐体积 (VVD)。第 3和4天分别增加到 1.0和1.3 VVD。细胞生物量增加到目标水平的生长阶段持续到第 8 天。在此阶段，收获液废弃。重量控制用于基础培养基入口流速。控制收获流速，以保持生物反应器重量恒定，并使用在线电容信号控制废弃流速。如 Bielser 等人所述，该信号的设定点基于专门针对该细胞系和培养基组合测量的最小细胞特异性灌流速率 (CSPRmin)。交替式切向流过滤（ATF2）装置和孔径为 0.2 μm的聚醚砜中空纤维（Repligen）用于细胞截留。
GMP运行
在 200 L 一次性生物反应器 (Millipore) 中按 GMP 运行灌流细胞培养。以0.5 x 106 cells/mL的密度接种。细胞培养维持温度 36.5°C，DO 设定点为 50%。使用 CO2 或 1.1 M Na2CO3将 pH 值控制在 6.80 - 7.10。培养工作体积为 170 L。在第 2 天开始灌流并设置为 0.5 VVD。第 3和4 天分别增加到 1.0和1.3 VVD。控制基础培养基入口流速以保持生物反应器重量恒定。使用在线电容信号控制废弃流速和收获流速，并调整废弃流速，以保持目标反应器罐体积（图 2）。电容信号设定点设置为比参考运行低 10%。交替式切向流过滤（ATF6）和孔径为 0.2 μm的聚醚砜中空纤维（Repligen）用于细胞截留。一旦达到目标生物量（在 8 天生长阶段之后），温度降低到 33°C，24 小时后开始收集收获液以进行纯化。两次运行的持续时间都根据工厂规划和材料需求进行了调整，因此第二次 GMP 运行时间略短。GMP1 为 4个合并间隔（4 个 4 天合并池 = 16 天收集），而 GMP2 仅为2 个合并间隔（2 个 4 天合并池 = 8 天收集），因为持续时间不同。
其它步骤，包括缓冲液混合平台、Protein A层析、病毒灭活和过滤、精纯层析、纳滤、超滤/洗滤、制剂和最终过滤、以及分析和数据处理，请参考原文。
结果与讨论
详细的研究结果和讨论，请参考原文。
上游设备升级
GMP工厂已经配备了一个 200 L的一次性生物反应器。研究设计并实施了一个灌流控制单元来控制所需的液体流速，例如培养基添加、收获和废弃。收获流速由流量计控制，并根据目标灌流速率进行调整。用生物电容信号控制废弃，以将其保持在所需的设定点。废弃流速用流量计监测，该信息用于实时校正收获流速，以符合公式 1 给出的数学关系。使用反应器的重量监测控制培养基添加，并补偿收获和废弃通量。
𝑉R∙ 𝑃 = 𝐻 + 𝐵 = M (1)
其中，VR (L) 为反应器工作体积，P (s-1)为灌流速率，H (L∙s-1) 为收获流速，B (L∙s-1) 为废弃流速，M (L∙s-1)为培养基添加流速。
生物反应器升级设置
上游参考和GMP运行
下图包含参考和 GMP 运行的细胞培养数据。对于 GMP 运行，目标生物量基于电容测量设置为比参考运行低 10%。在收获阶段，GMP1 的生物量保持在 10.7 ± 0.7%，GMP2 的生物量保持在 12.2 ± 0.5%，而参考运行的平均水平为 13.2 ± 1.4%。在所有运行中，细胞活性都保持在 90% 以上。直接在细胞培养中测量的滴度大部分是匹配的（图 3C）。在两个参考运行中，滴度意外增加。这可能是收获液流意外中断的结果，该中断暂时阻止了通过过滤装置的正常流动，并可能导致在细胞截留装置中产生产品筛分。其它小规模运行和 GMP2 更稳定。与其它运行相比，GMP1 生物反应器中的蛋白质滴度不太稳定。在第 14 天和第 16 天之间观察到的降低与生物量的意外减少相关（由于意外事件，收获液流在短时间内中断）。反应器中的体积增加并稀释了产物。不同运行之间的 HMW 和 LMW 水平稳定且相似。
细胞培养性能
表1. 不同场景的DSP操作参数随着工艺类型、产品滴度和收获体积的变化而变化。不同的场景包括14天的补料分批工艺、2000-L规模cDSP的未来连续生产平台以及DSP批次操作直接转移到cDSP的200-L灌流工艺。粗体用于突出显示严格与cDSP平台匹配的参数，斜体用于突出显示不同的参数。
表2. USP细胞培养基粉末消耗、DSP缓冲液消耗、产量和标准化性能（如单位蛋白质数量的填料利用率）的理论比较。
总结
本研究描述了如何在 GMP 条件下使用批次和连续操作的混合方法生产 2.1 kg mAb，以用于 I 期临床供应。这一策略旨在通过开发连续性工艺（上游灌流和 cDSP）来提高临床物料的可用性，但并非所有用于完全连续生产平台的设备都可用或合格。为避免项目后期的任何工艺变化，所有 DSP 单元操作和工艺参数都经过设计，以适应未来的连续生产平台。
使用上述策略在预期质量范围内生产了临床物料。各个单元操作的设计受到现有设备所施加的限制，但适应了它们将在不久的将来转移到的连续操作。灌流细胞培养的放大是成功的，细胞培养数据和产物质量与小规模运行保持一致。不同 DSP 步骤的性能在小规模和 GMP 运行之间也是可重现的。该项目的后期阶段将需要将此工艺转化至设想的连续生产平台。本文中介绍的校准工作使我们高度相信未来连续生产平台的产品质量输出将与这里生产的产品相当。这项工作还有助于制定特定于连续操作的控制策略，并反映该平台可以从中受益的进一步改进。
原文：K.B.Ferreira,A.Benlegrimet, G.Diane, Transfer of continuous manufacturing process principles for mAb production in a GMP environment: A step in the transition from batch to continuous. Biotechnology Progress, 2022, https://doi.org/10.1002/btpr.3259.
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