工艺强化中的灌流应用
本文节选自来自Amgen的研究人员发表的文章《From Chemostats to High-Density Perfusion: The Progression of Continuous Mammalian Cell Cultivation》，由于水平有限，更多详细内容，请参考原文。
在过去的十年中，包括细胞截留装置的灌流细胞培养的多方面技术进步、一次性使用生物反应器、培养基优化以及细胞系的稳定性使工艺强化成为可能，2000 L灌流生物反应器可以产生与传统15,000 L补料分批生物反应器相似的产量。因此，更小、更便宜、更灵活的生产工厂已经成为进一步降低商品成本的可行方法。这种上游灌流工艺的强化，加上下游开发的进展，导致了整合式连续生物生产 (ICB) 的出现。
整合式连续生物生产（ICB）
ICB概念源于2010年代初，在2011年欧洲应用生物技术大会(ECAB)的一次全体演讲中被首次提出。如前文所述，传统的灌流生物生产工艺由连续运行的生物反应器和以批次模式执行的纯化单元操作组成。因此，需要多个储罐来适应下游操作的离散性质。相比之下，整合式连续生产工艺利用覆盖初步捕获和后续精纯步骤的连续层析原理，实现料液从上游到下游不间断地流动。在过去十年中，在将剩余的下游单元操作(如病毒灭活、过滤和制剂)从批次操作过渡到连续操作模式方面也取得了不小的进展。
通过连续工艺并消除中间储存步骤，与传统生物生产工艺相比，ICB仅需要更小的生产占地、更低的资本投入和运营成本，已有研究对其进行了详细的经济分析和工艺建模。此外，更小的生物反应器、层析柱和过滤器尺寸使基于ICB的GMP生产可使用一次性使用技术，从而在生物生产工厂设计和建造方面带来了革命性的模式变化。
完全整合的端到端连续流可在细胞生长、代谢、生产率和产品质量方面实现假稳态操作，相关的强化可使单位体积产量显著高于补料分批工艺。因此，ICB不再局限于酶和生长因子等不稳定产品的生产，对于在这些产品，滞留时间必须最小化，以确保产品质量。对于像单克隆抗体这样的稳定分子来说，ICB是一种非常有吸引力的形式，因为它具有良好的经济效益，且可积极影响生产工厂的高效设计和建造。过去十年的重点是将ICB概念从对不稳定产品的“必要性”扩展到对稳定产品的工艺强化的倾向性。
自2011年提出以来，ICB已成为生物药生产中一个快速发展的领域。到目前为止，行业已经组织了多次会议，汇集了来自工业、学术界、监管机构和设备供应商的思想领袖，共同推进这一新的生物生产模式。尽管仍存在诸多技术挑战，但在过去十年中，已有多个ICB开发和实施的成功案例。首次报道的ICB证实研究包括一个12 L灌流生物反应器和一个用于连续捕获的4柱PCC (周期性逆流层析)系统。在50 - 60 × 10^6 cells/mL的假稳态条件下，运行>60天，对于测试的mAb和酶产品，单位体积产率提高5-40倍，产品质量与对照的灌流或补料分批工艺相当。更重要的是，ICB配置通过消除多个中间性单元操作，大大降低了工厂占地。因此，如有需要，可通过增加额外的独立生产线（增加数量），以提高产能，而不需要进行体积性的规模放大。在构建未来的多产品工厂时，这种模块化方法已经成为一个关键的考虑因素，在这些工厂中，将需要灵活的生产能力来适应不同的产品数量或不同的市场需求。
在早期工作的基础上，研究论证了不间断、全自动、封闭系统的可行性，该系统由灌流生物反应器组成，连接到PCC单元操作。实验表明，该系统可连续运行30天以上，实验室规模的12L生物反应器的单抗产量为~10 g/day。与对照的补料分批工艺相比，上游和下游操作分别提高了10倍和6倍。资本和运营费用可进一步降低，填料利用率提高了25%，缓冲液使用量减少了20%，柱尺寸降低了>20倍。
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在另一项研究中，研究人员介绍了从细胞培养到层析、过滤、病毒灭活和制剂的真正连续的中试规模操作。为了快速构建一个灵活、小型、廉价且可持续的中试工厂，研究采用了四个关键的设计原则：1)ICB、2) 一次性使用设备、3) 封闭工艺以及4)D级环境下的“舞厅式”生产布局。研究使用两个10L灌流生物反应器，并行运行28天，模式mAb的产量超过5g/d，且产品质量在规格范围内。在另一项研究中，过程分析技术(PAT)、多元数据分析(MVDA)和反馈控制算法的整合被用于简化操作并确保一致的产品质量。此外，还使用了摄动分析，以了解上游偏差对其它下游单元操作的影响。最近，有报道介绍了一种100L中试规模的高度自动化、端到端ICB系统，其包括灌流生物反应器、PCC捕获和精纯、病毒灭活、病毒过滤、超滤/洗滤、制剂和除菌过滤。从100L灌流生物反应器中获得的模式mAb在25天内产量为200 g/d，产品质量可接受。这项工作为实现GMP、商业化ICB工艺迈出了重要的一步。
美国食品和药物管理局看好灌流和连续工艺，可以为工艺和产品质量控制提供一个稳健的平台。尽管如此，连续生产在被广泛采用方面还面临一些障碍。仍然存在的技术挑战阻碍了技术的实施，比如更长的工艺时间内的克隆稳定性。虽然灌流工艺和补料分批工艺的商品成本(COG)相似且两者之间的差距正在缩小，但更改或转换现有的基于补料分批工艺的基础设施的经济效益可能代表着一种财务上的权衡。最近的一项分析表明，在一般灌流工艺中，每升培养基产生的产品克数仍是常见补料分批工艺的44%。这一差距可以通过较低的年批次数和每年所需的生物反应器产能来抵消。另一项分析提供了类似的观点，表明一次性使用设备(2- 4 kL)和不锈钢设备(15 - 25 kL)的产品成本分别为$100+/g和$20-40/g。因此，为了实现连续生产的更多优势，公司需要根据每个项目的具体情况，鉴别机会点。尽管如此，ICB的核心设计原则将继续指导工艺优化的路径。
传统细胞培养工艺和灌流赋能的强化细胞培养工艺的比较。
用于细胞建库、种子扩增以及高密度接种的灌流技术
除了核心的细胞培养和蛋白质生产应用外，灌流技术也被用于其它工艺强化应用，以实现高密度细胞建库、简化种子扩增过程以及用于商业化生产生物反应器的高细胞密度接种(图1)。
高密度细胞建库
灌流技术可实现高密度 (> 50 x 10^6 cells/mL)和/或大体积细胞库，从而缩短小瓶解冻到生产的时间，使种子扩增过程更高效。早期应用灌流培养建立的大体积细胞库 (100mL 冷冻袋，20× 10^6 cells/mL或50mL冷冻袋，40 × 10^6 cells/mL)可使种子扩增时间缩短25 - 30天。高密度 (100 × 10^6 cells/mL；5mL体积) 细胞库可从结合灌流的波浪式生物反应器开始，其消除了种子扩增过程中所有的摇瓶阶段，降低了污染风险以及种子扩增的培养时间。在后来的研究中，来自灌流生物反应器的细胞以>70 × 10^6cells/mL的密度冻存在150 mL袋中，从而可从一个或多个冻存开始，显著加速种子扩增链。在另一项研究中，在该过程的多个阶段采用灌流技术，包括制备高密度细胞库 (4.5 mL冻存管，100× 10^6 cells/mL)和N-1阶段，以快速制备种子，用于生产生物反应器的接种。
基于灌流的种子生物反应器
以灌流模式操作种子生物反应器可获得高细胞质量累积，从而可使用更小的种子生物反应器接种生产生物反应器，和/或更少的中间放大步骤。这可减少工厂占地面积、操作的复杂性以及与设备转换相关的污染风险。在N-1培养阶段，使用~20 × 10^6 cells/mL和95%活性的灌流波浪式生物反应器，可减少扩增步骤，并消除2 -3个中间性种子生物反应器。针对一个配备了灌流技术的类似系统的研究表明，单个2 -5 L系统，可直接以0.2 - 0.5 x10^6 cells/mL的密度接种2000L生产规模生物反应器，消除所有中间规模 (50 L和200 L)生物反应器，从而大大简化了种子扩增过程。
N-1灌流实现高密度接种液生产
灌流N-1种子生物反应器可获得较高的终端细胞密度(> 50 × 10^6 cells/mL)，能够在生产生物反应器中以高细胞密度进行接种 (> 5 × 10^6 cells/mL，而传统工艺中的典型值为1 × 10^6 cells/mL)。在14天的运行过程中，可将非生产性细胞积累阶段缩短3- 5天，从而使生产力提高20 - 35%。结合用于细胞截留的倾斜式沉降器，采用3000 L N-1灌流生物反应器，以提高补料分批生产过程的接种细胞密度，可使生产时间减少20%，且不影响产品质量。在另一项研究中，单个N-1灌流生物反应器被用于重复接种生产生物反应器，最多可达3次，这进一步消除了转换时间，提高了效率。使用交替切向流(ATF)的N-1灌流能够消除生产链中的大多数种子生物反应器，并将细胞接种密度提高25倍，同时将生产时间从14天缩短到8天。在另一项研究中，使用ATF进行N-1灌流的波浪式生物反应器实现了生产生物反应器10 × 10^6 cells/mL的高密度接种。这将生产持续时间从17天减少到了12天，允许每年进行更多的运行 (产能提高增加30%)，且对生产率和产品质量没有不利影响。以基于ATF灌流的50 L N-1生物反应器进行高效的种子扩增，可使500L生产生物反应器中的接种密度达到5 × 10^6 cells/mL，减少了5天的非生产细胞生长。此外，N-1灌流应用是迈向完全整合的连续灌流工艺的第一步。
N-1灌流方法在生物制药行业的应用越来越多，已有多个新的案例报告。混合 (灌流 + 补料分批) 细胞培养工艺结合N-1灌流可实现5× 10^6 cells/mL的生产生物反应器接种密度，随后在培养前4天进行灌流可使细胞密度迅速增加到~80 × 10^6 cells/mL。N-1灌流细胞培养也被用于其它生产形式，如灌流和连续流搅拌罐生物反应器。最近，有报道称，非灌流N-1也可以用于生产补料分批生物反应器的接种，最高可达5 × 10^6 cells/mL。然而，N-1灌流可达到高得多的接种密度。使用N-1灌流已使生产生物反应器接种密度增加到了10 - 20 × 10^6 cells/mL，再加上重新设计的细胞培养基，生产效率可翻倍，且该策略已规模放大到了1000 L。在另一项研究中，基于TFF的N-1灌流成功地用于补料分批生产反应器的接种，密度10 × 10^6 cells/mL，随后与低接种密度培养相比，产量翻了一倍。
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总的来说，尽管需对现有的生产工厂进行一些必要的调整，但工艺强化的好处是巨大的，灌流技术可实现高密度、大体积细胞库和高密度细胞接种液，且正越来越多地被用于生物制药行业。这些办法的优势将取决于工艺和工厂，且必须从整体上确定进行工艺和工厂更改可实现的强化经济效益。高接种密度的强化生产工艺依赖于将生长阶段的细胞质累积部分从生产生物反应器转移到种子生物反应器。这些种子生物反应器的规模和调度必须针对最大的工厂产量和整个工艺的经济性进行优化。类似地，使用高密度和大体积细胞库的简化和/或缩短的规模放大过程需要在更复杂的细胞库工艺上进行前期投资。彻底的工艺和工厂建模演练将使部署这些技术的好处最大化。
原文：H.E.Wong, C.Chen, H.Le, et al., From Chemostats to High-Density Perfusion: The Progression of Continuous Mammalian Cell Cultivation. Chemical Technology and Biotechnology, 2021, https://doi.org/10.1002/jctb.6841.
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