【中药/天然分子设计】天然产物来源变构调节剂的药物研发展望
寻找靶标明确的活性先导物是新药研发的源头创新环节。在这个过程中，除了需明确化合物靶标蛋白的种类及其调控的通路(即what and how)外，还需阐明化合物与蛋白的作用位点(where)。目前，绝大多数上市药物都是针对于负责酶的催化活性/受体-配体结合位点/蛋白-蛋白相互作用(Protein-Protein interaction, PPI)的正构/催化位点(orthosteric/catalytic site)。然而，由于正构位点在进化中相对保守，正构药物往往对于同类蛋白的选择性不强。相比之下，变构位点特异性较强，为药物研发提供了新的选择。除了靶向性更强的优点外，变构药物也可通过与正构药物联用来改善正构药物药效下降等问题。
此外，变构药物在PPI调节剂方面也具有独特的优势。近些年，变构调节剂的发展取得了显著的进展。根据全球变构资源中心ASD(http://mdl.shsmu.edu.cn/ASD)的统计，从2000年至今，变构化合物的数量已经从最初不到1000个，发展到了8万余个，其靶标涉及超过1300种蛋白。这一方面是由于人们逐渐认识到变构调节剂的潜力，另一方面也要归功于化学生物学、生物信息学、结构生物学等多学科的发展。其中，超过70%的变构调节剂是采用动力学与实验结合的方法筛选，其次为细胞水平的功能性筛选，还有少数的研究利用了结构生物学的方法。
目前上市的药物中，有仅一半的药物直接或间接的来源于天然产物，提示我们天然产物在变构药物领域同样具有巨大的研究潜力。利用ASD对变构调节剂进行研究，可以识别超过200个天然产物来源的变构调节剂。数据分析表明，这些天然变构调节剂的发现多源于随机发现，仅有少部分针对成熟靶点的筛选。
以ASD (包括79290个变构调节剂，含461个处于研究阶段和19个已上市的变构药物)、UNPD-ISDB (包含208 240个天然产物)、DrugBank (包括11452个化合物，含2255个上市药物)和iPPI-DB (含1854个非肽类PPI抑制剂)等数据库为基础，利用主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)进一步分析了天然变构调节剂的结构特征（如原子极化率、分子连接性、π体系、杂原子数目、分子芳香性等）。结果发现，相比于传统Drugbank数据，变构调节剂(淡紫色点，来源于ASD数据)的分布主要在“药物组”的外沿(B图)或Q4象限(C图)，提示变构调节剂具有与传统正构药物不同的结构特点。上述结果还进一步佐证了天然产物具有丰富的化学多样性，既具有上市药物和正构化合物的特征，也展示了与变构化合物类似的结构特点，是药物研究的宝贵资源。
根据ASD收录的天然产物来源结构，可以将221个天然变构调节剂分为15种结构类型，并列举了其中的代表性结构。从图中可看到，天然变构调节剂多含有芳环或多环体系，具有较为刚性的结构。此外，天然变构调节剂多具有高度氧化的特征。仅有10%的天然变构调节剂含有氮原子。这与传统上对变构药物的认识一致。有趣的是，虽然位于Q3象限的变构调节剂仅占所有变构调节剂的1%，但有约20%的天然变构调节剂位于该象限(多为三萜类化合物)，体现了天然产物的独特性。与此同时，卤素等其它结构片段也对这些天然变构调节剂的亲和力、药代参数等做出了重要贡献。
天然产物的独特性孵育了这些分子良好的研究潜力和开发价值。虽然天然产物常常被诟病具有难以持续获得的缺点，但这个问题可以通过结构简化或化学合成/生物合成的方式来解决。除资源问题外，天然产物也可以通过改变给药方式的方法来规避其潜在的药物代谢的问题。例如，位于PCA分析中第四象限的紫杉醇、长春新碱等微管稳定剂(microtubule stabilising agents, MSAs)可通过静脉注射来应对其口服生物利用度较差的缺点。事实上，著名的“类药五原则”仅针对于口服药物，并不能用于排除生物有效的化合物。
相比之下，真正在天然药物研究中需要特别留意的是所谓的“泛阳性化合物”(即pan-assay interference (PAINS) compounds。泛阳性化合物指的是那些在多个模型的高通量筛选实验中都被认为是“苗头化合物”，但在接下来的结构优化中并没有多少改造潜力，也不适合用于做化学探针的化合物。事实上，目前国内外领先的制药公司都投入了巨大了人力物力来发展“去泛阳性化合物体系”，以优化其化合物库，并对它们前期研究中发现的苗头化合物进行二次评价。通过采用网络数据库对上述221个天然变构调节剂进行泛阳性排查，有76个化合物(或其子结构)被标注为泛阳性化合物，它们主要是色酮类、查耳酮类和醌类化合物。当苗头化合物被标记为泛阳性化合物时，可采用一系列的方法对这些所谓的“泛阳性化合物”进行验证：首先，我们要区分这些化合物是否是该靶点是否发生了特异性结合。理想情况下，特异性结合应该通过结构生物学的方法进一步证实，例如通过获得蛋白质配体复合物晶体结构。随后，可通过药物化学的手段对苗头化合物进行衍生化，并进行构效关系(SAR)分析。特异性结合的化合物通常具有明确的构效关系。此外，我们还可以测试苗头化合物和其它蛋白的结合能力，以判断化合物对蛋白的选择性和脱靶效应。特别是对于变构调节剂，因为变构位点通常在进化过程中是非保守的，因此，该方法可以很好的判断候选分子是否为泛阳性化合物。
以2008-2018年10年中发现的天然变构调节剂为探针，科学家们共鉴定出涉及不同生命过程的共81种蛋白，并将其分酶、G蛋白偶联受体、膜转运蛋白、转录因子和其它蛋白共五类。其中，酶占据了所有靶标蛋白的77%，这一定程度上是因为目前天然变构激动剂的发现过于依赖动力学的方法。这些酶可进一步分为4类：氧化还原酶(如细胞色素P450)、转移酶(以各种激酶为主)、水解酶(其中73%为磷酸酶、蛋白酶和糖基化酶家族)和其它酶(如裂解酶和异构酶)。事实上，变构调节剂可作用于一系列非酶蛋白靶标，这些靶标蛋白也非常具有研究潜力。上述天然变构调节剂对其靶蛋白的作用可分为三类：(1)改变正构/催化位点的局部构象；(2)改变蛋白的动力学特征；(3)通过变构位点调节PPI作用。
实例1：变构调节剂可引起催化位点区域的构象变化（PTP1B）
以PTP1B为代表的蛋白酪氨酸磷酸酶家族(PTPases)在多种通路的调控中起着重要作用。尽管PTPases种类众多，但其活性位点高度保守。因此，研制具有选择性的PTPases抑制剂具有重要的临床意义。近年来，随着蛋白质磷酸酶的天然变构抑制剂的报道，科学家们对PTPase药物的研发燃起了新的希望。大多数已报道的天然变构PTPase抑制剂的IC50值在低至亚微摩尔范围内，是最有效的PTPase抑制剂之一。目前发现的天然产物作用的PTPases变构口袋主要有三个，它们分别位于：1) 外位点(exosite)；2) C端无序非催化域；以及3) 催化位点附近的变构位点(如下图)。虽然在这些例子中，这些变构小分子和它们作用位点不同，但它们具有类似的作用机制：PTPase中负责催化的WPD区域是非常柔性的，至少存在两种构象态。开放构象与非活性构象有关，而封闭构象对PTPase的催化活性是至关重要的，该构象在与底物结合后趋向稳定。上述的变构抑制剂稳定了WPD的开放构象，使得PTP1B处于非活性状态。
Trodusquemine是这种作用机制的代表性化合物。该化合物在2000年被报道，随后的表型研究表明，该化合物具有广泛而显著的药理活性。进一步的研究表明，PTP1B是该化合物的主要作用靶标。随后的研究表明，PTP1B与trodusquemine的相互作用发生在两个不同的变构位点，它们通过正协同作用相互影响，Kd分别为0.3 μM和1 μM。Trodusquemine可与PTP1B的第一个位点结合可引起C端无序延伸区域的构象变化，而位于α-螺旋9′上的PTP1B残基在该结合中发挥了重要作用。Krishnan等人的研究表明，trodusquemine可通过与由α螺旋7和9形成第一个位点结合，进而引起α螺旋7、3、6的构象变化，形成第二个结合口袋——该口袋与外位点(exosite)部分重叠，最终影响PTP1B的WPD loop区，使得该蛋白处于非活化构象中(如上图)。在这个过程中，化合物与C端(即第一个结合位点)的结合是至关重要的。目前，trodusquemine已通过了I期和Ib期临床试验，而II期临床试验主要是针对糖尿病、肥胖等适应症。
Trodusquemine的例子很好的说明了天然产物是如何为药物研发领域带来新思路的。在这个例子中，PTP1B作为一个已研究超过20年的“老靶点”，仍然缺乏具有选择性和细胞通透性抑制剂。通过天然产物化学与化学生物学、结构生物学等多学科合作，发现了PTP1B的全新的作用位点。利用复杂的、由配体诱导的构象变化，使蛋白稳定在非活性状态下，进而发挥抑制作用。
实例2：变构调节剂可引起蛋白动力学的整体变化(20S蛋白酶体）
蛋白酶是维持细胞稳态的关键酶，与多种疾病相关。蛋白酶具有共同的活性位点，因此很难有选择性地靶向蛋白酶。目前，大多数蛋白酶抑制剂都是非选择性竞争抑制剂，具有明显的副作用。20S蛋白酶体是一种约700 kDa的多蛋白水解复合物，是一种N端水解酶，负责细胞内蛋白质的非酶体降解。目前已有硼替佐米、卡菲佐米和伊沙佐米三种蛋白酶体抑制剂上市，它们都是具有高度亲电活性的多肽。然而，上述药物的毒副作用较大，且对实体瘤的渗透性较差，制约了这些药物的临床应用。因此，寻找具有全新化学骨架、选择性更佳的变构调节剂有望为下一代蛋白酶抑制剂提供思路。
20S核粒子(core particle, CP)是由两个外部α环和两个内部β环组成的圆柱形结构，每个β环由7个亚基组成。在真核生物中，20S蛋白酶体有6个催化位点，它们都具有相似的N端水解酶特征，但具有不同的底物和抑制剂偏好。20S蛋白酶体受到11S和19S调控蛋白的调控。这两种蛋白负责特定的底物识别，可打开圆柱体通道，让底物蛋白进入催化中心并将其降解。此外，20S核有3个内部腔室，两个形成于蛋白酶体CP入口的α-β环界面之间，一个中心腔室形成于6个β亚基内。它们显示出相邻的小口袋，可以被小分子结合。此外， 20S蛋白酶体CP的动力学研究已证实其对20S CP调控和催化的重要性。蛋白酶体动力学可以被调节蛋白、底物和催化位点抑制剂变构调节。
已有研究表明，天然产物雷帕霉素和氯喹可以通过调节蛋白水解复合物的构象动力学发挥蛋白酶体的变构抑制剂的作用。变构途径可以多种途径改变蛋白酶体构象的平衡,使得CP处于非活化构象。这些途径包括：调节的CP圆柱体的开/关、阻碍CP与其激动剂的相互作用，以及避免底物多肽与对应的催化亚基发生进一步的反应。TROSY核磁图谱分析结果表明，氯喹与蛋白酶体的α-β界面结合，将20S CP的平衡态从多个异构体转变为非活性态，从而通过变构途径调节功能。天然产物雷帕霉素也能动态抑制蛋白酶体。Osmulski和Gaczynska使用原子力显微镜(AFM) 20S蛋白酶体的CP进行了分析，结果发现雷帕霉素与CP孵育后，20S CP的孔径发生变化，使得其圆柱体通道处于打开的状态。
实例3：变构蛋白-蛋白相互作用调节剂(CBP/p300)
在转录过程中，转录因子通过与共激动蛋白(coactivator)和共抑制蛋白(corepressor)相互作用来调控其生物学功能。CBP/p300是与多种转录因子相互作用的共激活蛋白，如CREB、Myb和p53，进而调节它们的DNA结合和转录活性。CBP/p300共激活因子具有5个蛋白相互作用域。其中，CBP/p300的GACKIX结构域在转录因子激活中起关键作用，是其与靶向转录因子转录激活域(TADs)相互作用的重要界面。GACKIX结构域与p53、MILL、c-Jun、CREB、c-Myb和Tax的TADs相互作用。这些相互作用在一些生物过程和疾病中很重要。CBP/p300的GACKIX域显示了两个结合位点，它们可变构、协同地与TADs结合，根据它们的拓扑性质，分别被称为“深”和“浅”位点。
2012年Majmudar等人拟通过荧光偏振分析的方法寻找对GACKIX-MLL TAD相互作用具有抑制作用的化合物。经过大量的筛选工作，该团队从65000个样品(其中50000个是合成化合物)中筛选得到了2个具有活性的样品，均为天然产物提取物。通过一系列的色谱学技术，他们获得了3个具有活性的天然产物，包括sekikaic acid。通过荧光实验和核磁共振研究，研究人员证实了该化合物确实可与该蛋白发生相互作用。此外，他们还进行了细胞功能分析和分子动力学模拟。
研究表明，sekikaic acid与GACKIX结构域的相互作用是发生在MLL(下图橙色部分)和c-Jun转录激活因子结合的“深”位点。小分子与GACKIX结构域的的结合了蛋白构象的改变，进而影响了GACKIX域与其它共激动剂(如CREB、c-Myb，下图中的黄色部分)的结合。与此同时，在GACKIX浅层的位点Lys662(图中蓝色部分)也发生了位移，而这个位点又与CREB的pSer133相互作用有关。综上所述，酚酸类化合物sekikaic acid可与CBP/p300的GACKIX结构域结合，选择性地破坏了CBP/p300与其转录激活因子MLL和KID (CREB)的相互作用。有趣的是，sekikaic acid不与其它共激动剂(如Med15和VP2)相互作用，对CBP/p300的GACKIX域展示出了良好的选择性。除此之外，研究人员也研究了lecanoric acid和lobaric acid对GACKIX 的影响。Lobaric acid表现出TAD结合抑制，而lecanoric acid并没有展示出任何的活性。这可能是由于后者的结构更加柔性导致的。柔性阻碍了化合物与GACKIX结构域的稳定结合。
前景与展望
正如同正构药物研发一样，天然产物也有望开发为新型变构调节剂。然而，由于很多天然产物往往具有泛阳性的特征，因此在研究中需要仔细加以排除。化学生物学及生物物理学方法的发展可以帮助排除部分具有非特异结合的天然变构调节剂，为进一步的深入研究提供了可靠的前期基础。当前关于天然变构调节剂的研究仍然十分有限，但考虑到由于天然产物的独特性和复杂性，如果能获得有效、高质量的靶标生物学数据，这些天然变构抑制剂将成为揭示新型变构机制的有力武器。
参考文献
1. Q. Shen, G. Wang, S. Li, X. Liu, S. Lu, Z. Chen, K. Song, J. Yan, L. Geng, Z. Huang, W. Huang, G. Chen and J. Zhang, Nucleic Acids Res., 2016, 44, D527–D535
2. S. Lu, X. He, D. Ni and J. Zhang, J. Med. Chem., 2019, 62, 6405–6421.
3. Bruder M, Polo G, Trivella DBB. Nat Prod Rep. 2020, 37(4):488-514. doi: 10.1039/c9np00064j.
相关文章