【First-in-class药设系列】EGFR变构抑制剂在非小细胞肺癌治疗中的进展

肺癌是全世界第二大癌症，具有高患病率及致死率，每年约占癌症相关死亡总数的三分之一。非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer， NSCLC）是肺癌的主要亚型，占所有肺癌病例的85%。表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor, EGFR）属于ErbB或HER/ErbB家族，是一种细胞表面受体酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinase, RTK）。它包含一个富含半胱氨酸的胞外配体结合结构域，一个包含酪氨酸激酶（Tyrosine kinase, TK）位点的胞内结构域，以及包含自磷酸化位点的C端尾部。EGFR在细胞生存和增殖、迁移、血管生成和细胞死亡的多种细胞信号通路中具有重要作用。

EGFR催化结构域的突变会介导更高的激酶活性和配体独立性，如EGFR编码基因中的L858R（第21外显子单核苷酸替换）和第19外显子缺失（delE746-A750），从而导致癌症的开始和进展，NSCLC就是其突变诱发癌症中的一种。当前用于NSCLC一线治疗的是吉非替尼（gefitinib）和厄洛替尼（erlotinib）。但使用这些药物治疗几个月后，NSCLC的细胞出现耐药继发点突变T790M。T790M突变与其他致癌原性突变相比，增强了对ATP的亲和力，从而导致现有药物不易结合。

    为了治疗T790M突变介导的耐药NSCLC患者，研究人员设计并开发了第二代EGFR-TKIs，以共价的形式结合EGFR ATP结合位点上的半胱氨酸（Cys797）残基。不幸的是，由于靶向剂量依赖性的毒性和严重的副作用，第二代EGFR抑制剂在临床水平上的疗效有限。考虑到这些问题，研究人员开发出了第三代针对突变体的选择性、不可逆EGFR抑制剂。这些抑制剂大多通过靶向T790M突变型EGFR的ATP结合口袋，与Cys797形成共价键，克服了T790M突变型NSCLC患者的耐药性。尽管初始疗效令人印象深刻，但由于EGFR ATP结合口袋边缘出现的C797S突变，第三代EGFR-TKIs的敏感性大大降低。目前EGFR第一到第三代抑制剂都是针对EGFR-TK结构域的ATP结合位点设计的，因此，有必要发现结合在其他位点的化合物，以克服T790M和C797S突变介导的对EGFR-TKIs的耐药性。近年来，第四代EGFR变构抑制剂可以结合ATP结合口袋以外的变构位点，成为突变型NSCLC的一种治疗选择。这些变构抑制剂的初步研究表明，虽然它们单独使用时效果微弱或无效，但联合疗法可以发挥完全的效力。

一、EGFR-TKIs概述

美国范德比尔特大学的斯坦利·科恩因因发现表皮生长因子（EGF）及其受体而获得诺贝尔奖。对能够抑制酪氨酸激酶的分子的研究始于20世纪60年代。迄今为止，研究人员已经设计/发现了四代小分子EGFR-TKIs。厄洛替尼和吉非替尼是第一代EGFR-TKIs药物中最重要的两种，已获美国食品和药物管理局（FDA）批准用于晚期NSCLC患者的治疗。厄洛替尼和吉非替尼能够可逆结合于EGFR的酪氨酸激酶结构域，抑制EGFR的激活及其后续的下游信号通路，但大多数用药患者在治疗几个月后就由于T790M突变而对第一代EGFR-TKIs产生耐药性。第二代EGFR-TKIs，如阿法替尼（Afatinib）、达科米替尼（Dacomitinib ）和那拉替尼（Neratinib），是通过与EGFR ATP结合位点的Cys797残基共价结合，克服第一代EGFR-TKIs T790M突变介导的耐药性。由于剂量依赖的副作用，如皮疹和胃肠道疾病，限制了第二代EGFR-TKIs的进一步临床应用。大多数第三代EGFR-TKIs被设计成不可逆靶向T790M突变型EGFR，如奥西替尼（osimertinib）、罗西替尼（rociletinib）和奥尔穆替尼（olmutinib），但会受到ATP结合口袋C797S突变而耐药。近来。第四代EGFR-TKIs，如EAI001和EAI045，作用于与EGFR的ATP结合位点相距较远的变构位点，可以克服第三代EGFR-TKIs的T790M和C797S突变耐药。

Generation	Name	Limitations/failure
First-generation  EGFR-TKIs	Erlotinib	Resistance emanation due to T790M  mutation, dysregulated EGFR signaling (MET amplification, FGR bypass  signaling, HER2 amplification, HGF overexpression, and IGF1R abnormalities)  and mutated EGFR downstream signaling (BRAF mutation, K-RAS mutation, loss of  PTEN, and PIK3CA mutation). Targeting wild type EGFR leads to severe  side-effects dose-dependent toxicity in patients also limited the use of  first-generation EGFR-TKIs.
Gefitinib
Icotinib
Second-generation EGFR-TKIs	Dacomitinib	During phase II clinical trial  patients earlier treated with first generation EGFR-TKIs did not show  improvement in their overall survival.
Neratinib	Effective and significant results  were not observed during phase II clinical trial in EGFR mutated NSCLC  patients.
Afatinib	During clinical trials no change  in overall survival of patients were observed.
Third-generation  EGFR-TKIs	Nazartinib	Resistance emanation due to  EGFR-based mechanisms such as emergence of EGFR mutations (C797S, C797G,  E709K, G796, L718, L792, L798, and L692V mutations) and EGFR-independent  mechanisms such as dysregulated EGFR signaling (MET amplification, FGR bypass  signaling, HER2 amplification, HGF overexpression, and IGF1R abnormalities),  and mutated EGFR downstream signaling (BRAF mutation, K-RAS mutation, loss of  PTEN, and PIK3CA mutation).
Naquotinib
Olmutinib
Rociletinib
Osimertinib
Fourth-generation EGFR-TKIs	EAI001	Still not approved at clinical  level and not significantly effective as an anticancer agent alone in  preclinical studies.
EAI045
DDC4002
DDC-01-163

二、治疗T790M/C797S NSCLC的EGFR变构抑制剂

L858R/T790M和C797S突变导致的EGFR-TK耐药问题，推动了第四代EGFR-TKIs的发现。酪氨酸激酶受体有三个结合位点：失活位点、ATP竞争位点和变构位点。由于配体或药物无法与失活位点结合，不可能以此为靶点；ATP结合位点是目前第一到第三代EGFR-TKIs的结合位点；因此，变构位点是克服突变的希望所在。在最初寻找变构抑制剂时，Engel等人对80株NSCLC细胞系进行了表型筛选，得到对耐药H1975细胞系（L858R/T790M）具有特异性抑制作用的化合物1a。研究人员还设计、筛选和优化了一系列新抑制剂，从中筛选出5b和6a。Jia等使用纯化的靶蛋白L858R/T790M EGFR激酶进行了生化筛选，发现非ATP竞争的第四代EGFR变构抑制剂（EAI001）。EAI001结合在T790M突变体EGFR ATP结合位点旁边的变构位点，其羧酸酰胺的NH基团与Asp855形成氢键。EAI001的IC50值为24 nM，高于野生型EGFR （IC50> 50 μM），且EAI001对L858R和T790M单突变体的IC50分别为0.75 μM和1.7 μM。进一步优化EAI001获得EAI045，其对L858R/ T790M突变体EGFR （IC50 = 3 nM）的选择性比野生型EGFR高出约1000倍。重要的是，EAI045在其药理安全性评价中对非激酶靶点也有较高的选择性。此外，通过将5-吲哚取代基连接到EAI001的异吲哚酮上，研究人员还设计了一种新的EGFR变构化合物JBJ-02-112-05，对L858R/T790M突变体EGFR的IC50为15 nM。进一步优化JBJ-02-112-05获得了EGFR变构抑制剂JBJ-04-125-02，对T790M/L858R突变体EGFR的IC50为0.26 nM。类似地，针对EAI001的基本结构，Dries开发了EAI002，显示出相对于野生型EGFR，突变型EGFR具有良好的选择性。随着PROTAC技术的发展，由EAI001化学改造得到的新的EGFR突变体（L858R/T790M）选择性变构降解体JBJ-07-149，体外IC50 = 1.1 nM。在此基础上，进一步优化获得DDC-01-163、JBJ-07-038和JBJ-07- 200。体外生化筛选结果表明，与亲本JBJ-07-149相比，DDC-01-163对EGFR L858R/T790M突变体（IC50 = 45 nM）具有可接受的生化活性。

三、EGFR变构抑制剂的药代动力学

临床前研究表明，第四代EGFR变构抑制剂EAI045具有令人满意的稳定性、生物利用度、排泄和组织分布。Jia对EAI045的药代动力学分析表明，在小鼠模型中，20mg /kg口服该药物的最大血药浓度为0.57 μM，半衰期为2.15 h，口服生物利用度为26%。口服（30 mg/kg）和静脉注射（2 mg/kg） EAI045治疗小鼠的血浆分析显示，24小时的平均血浆浓度（Cmax/C5 min）分别约为1275.802 ng/mL和1831.146 ng/mL。重要的是，EAI045在各组织中吸收迅速，分布广泛，肝脏是其代谢的主要器官。与之相比，最近开发的EGFR变构抑制剂JBJ-04-125-02比EAI045具有更强的抗增殖活性。JBJ-04-125-02静脉注射3mg /kg， 3 h半衰期中等，曲线下高面积为728577 min-ng/mL，但该化合物（20 mg/kg体重）的口服最大血浆浓度值为1.1 mmol/L，生物利用度仅为3%，提示该化合物可能开始在患者血浆中积累。EGFR变构抑制剂若要作为一种抗肺癌药物，还需要更多的药代动力学研究。

四、EGFR变构抑制剂的临床前和临床现状

EGFR变构化合物EAI001和EAI045可以克服T790M突变介导的ATP亲和力增强，并可能降低T790M突变体EGFR的自磷酸化。这些化合物与激酶的变构位点结合，通过将调节C-螺旋向外朝向，提供了酪氨酸激酶结构域的稳定性。在初步的临床前研究中，EAI045显示出对L858R/T790M/C797S突变体EGFR有良好的靶向选择性。EAI045可能降低但不能完全抑制L858R/T790M突变型NSCLC细胞株H1975和成纤维细胞细胞株NIH-3T3中EGFR的自磷酸化。同样的研究证实，EAI045处理抑制了H1975细胞系Y1173位点EGFR的磷酸化（IC50 = 2 nM），而对l858R突变的H3255细胞系表现出中度活性。EAI045未诱导角质形成细胞HaCaT中野生型EGFR磷酸化的抑制。EAI045对L858R和L858R/T790M突变体Ba/F3细胞有抗增殖作用，但对T790M/exon19del或亲本Ba/F3细胞无作用。这些结果证实了EAI045对突变型EGFR的选择性高于野生型EGFR。然而，EAI045对H1975和H3255细胞株的半数抗增殖效应需要大约10 μM浓度，比体外IC50剂量高得多。在体内疗效上，EAI045在L858R/T790M突变体和L858R/T790M/ C797S突变体肺肿瘤异种移植小鼠中未显示明显的肿瘤消退。这些发现表明EAI045作为单一药物治疗EGFR突变型NSCLC患者的临床疗效有限。

    另一种EGFR变构抑制剂JBJ-04-125-02在携带L858R、L858R/T790M或L858R/T790M/C797S突变的Ba/F3细胞株中显示出强大的抗增殖和下游AKT和ERK 1/2磷酸化抑制活性。然而，该化合物在亲本Ba/F3或野生型EGFR Ba/F3细胞中均未显示出任何生长抑制活性，表明突变型EGFR对野生型EGFR具有靶向选择性。与奥西替尼相比，纳摩尔浓度的JBJ-04-125-02在L858R/ T790M突变型H1975细胞和肿瘤移植物中分别表现出更强的抗增殖和肿瘤抑制活性。

    EGFR变构降解剂DDC-01-163对L858R/T790M突变型Ba/F3细胞（IC50 = 0.096 μM）与野生型Ba/F3细胞（IC50 >10 μM）具有选择性抗增殖活性。尽管在生化分析中，DDC-01-163 （IC50 = 0.096 μM）的效力低45倍，但细胞分析发现，DDC-01-163 （IC50 = 0.096 μM）的效力比其亲代变构EGFR抑制剂JBJ-07-149（IC50> 4.9 μM）强51倍。三级突变，如L858R/T790M/C797S和L858R/T790M/L718Q EGFR，在非小细胞肺癌中发生奥西替尼获得性耐药是众所周知的。有趣的是，DDC-01-163对携带L858R/T790M/C797S （IC50 = 0.041 μM）和L858R/T790M/L718Q （IC50 = 0.028 μM） EGFR突变的Ba/F3细胞株具有抗增殖活性。同一研究证实，DDC-01-163（0.1 μM）对L858R/T790M/C797S和L858R/T790M/L718Q EGFR突变细胞人癌细胞的降解率分别为74%和71%。

五、EGFR变构抑制剂的联合用药治疗策略

体外和体内研究表明，将EGFR变构抑制剂作为单一治疗药物用于非小细胞肺癌的治疗可能不是那么有效。在这种情况下，将变构EGFR抑制剂作为一种联合治疗为NSCLC提供了一种有效的治疗选择。在L858R/T790M突变型Ba/F3细胞中，EAI045与西妥昔单抗（10 mg/mL）联用虽无效，但对EGFR二聚化具有协同阻断作用，抗增殖作用（IC50 = 10 nM）。同时，口服EAI045 （60 mg/kg/天）和西妥昔单抗（腹腔内；每隔一天1毫克）诱导具有L858R/T790M或L858R/T790M/C797S EGFR突变体的小鼠异种移植瘤模型的肿瘤生长显著下降。EAI045几乎符合理想联合化疗方案所需的所有标准，如EGFR突变型对野生型的选择性，以及与西妥昔单抗联合使用时的协同作用。

    另一种EGFR变构抑制剂JBJ-04-125-02联合奥西替尼正在用于治疗非小细胞肺癌中EGFR介导的突变耐药发生。在奥西替尼 （0.1 μM）耐药肺癌细胞株（H3255GR）中，1-10 μM的JBJ-04-125-02联合使用，使得奥西替尼的促凋亡能力和疗效显著增加。此外，JBJ-04-125-02 （100 mg/kg）与奥西替尼（2.5 mg/kg）联合治疗对异种移植小鼠模型肿瘤生长的抑制作用比单独使用两种药物都要大得多。

    同样，最近开发的变构EGFR降解剂DDC-01-163 （0.01 μM和0.1 μM）在一定剂量下协同增强奥西替尼（0.01 μM）的抗增殖和凋亡能力。当变构抑制剂与传统药物联合用药时可以观测到明显的协同作用，即变构药物的治疗潜力。这表明变构EGFR抑制剂有可能增强传统EGFR-TKIs治疗EGFR突变型NSCLC的临床疗效。这需要更多的临床前和临床水平的研究来验证变构EGFR抑制剂作为非小细胞肺癌的联合治疗的作用。

EGFR变构抑制剂未来展望

尽管EGFR-TKIs（第一代到第三代）的治疗效果有了实质性的改善，但它们仍然不能给NSCLC带来足够的治疗缓解。EGFR突变（T790M和/或C797S）导致EGFR-TKI与EGF受体结合能力丧失，导致不可避免的耐药。研究的结果显示表皮生长因子受体的变构位点具有抑制癌细胞增殖的潜力。同时，针对EGFR变构位点为治疗EGFR突变型NSCLC提供了一种高效、选择性的新治疗策略。EGFR活性位点的T790M和C797S突变不影响EGFR变构抑制剂的疗效，因为它们针对的是EGFR的变构位点，而这一位点发生在ATP结合位点之外。然而，这些抑制剂目前处于开发阶段，由于受体二聚化，其作为单一药物对EGFR突变型NSCLC并不特别有效。在这种情况下，联合使用EGFR变构抑制剂与常规化疗或免疫治疗是克服EGFR突变诱导的NSCLC耐药的高效策略。目前已有的研究表明，EGFR变构抑制剂与化疗或免疫治疗的联合治疗比单独使用这两种药物更有效。最后，EGFR变构抑制剂的联合治疗前景正在迅速出现；然而，还需要更多的临床前和临床研究来进一步证实它们联合治疗EGFR突变体耐药NSCLC患者的疗效。

参考文献

1.  Tripathi S K , Biswal B K . Allosteric mutant-selective fourth-generation EGFR inhibitors as an efficient combination therapeutic in the treatment of non-small cell lung carcinoma[J]. Drug Discov Today, 2021, /10.1016/j.drudis.2021.02.005

2. Guardiola, S. et al. A Third Shot at EGFR: New Opportunities in Cancer Therapy. Trends Pharmacol. Sci. 2019, 40 (12), 941–955

3. Jia, Y. et al. Overcoming EGFR (T790M) and EGFR (C797S) resistance with mutant-selective allosteric inhibitors. Nature 2016, 534 (7605), 129–132

相关阅读