【First-in-class药设系列】MTAP缺失肿瘤的新型MAT2A抑制剂设计
代谢酶甲硫氨酸腺苷转移酶2a (Methionine adenosyltransferase 2a, MAT2A)作为通用甲基供体S -腺苷蛋氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)的主要生产者，在代谢和表观遗传学中具有重要作用。最近的研究表明MAT2A的与一个单独的代谢基因甲硫腺苷磷酸化酶(Methylthioadenosine phosphorylase, MTAP)的共缺失导致了在癌症中选择性的抗增殖作用。这种选择性合成致死的一种可能性解释是，当MTAP基因被删除时，代谢物5’-甲基硫腺苷(5'-methylthioadenosine, MTA)会积累，从而抑制利用SAM的II型精氨酸甲基转移酶PRMT5(Protein arginine methyltransferase 5)的活性。在MTAP缺失的癌症的高MTA环境中，PRMT5的催化活性降低，并对SAM水平的降低的活性抑制作用更敏感。虽然这些结果表明，靶向MAT2A可能对MTAP缺失的癌症有益，但过去报道的体外有效的MAT2A抑制剂，因细胞适应性而降低了MAT2A抑制剂的细胞效能而无法起效。
近期, 有研究人员开发了全新骨架的MAT2A小分子抑制剂，这些抑制剂是有效的，细胞通透性的，并且易于在体内测试。MAT2A抑制剂通过阻断SAM的新生生物合成，有效地降低了细胞中SAM的水平。利用MAT2A的药理抑制剂，研究人员验证了MAT2A在MTAP缺失的癌症中作为合成的致死靶点，证明了在体外抑制癌细胞增殖和体内抑制肿瘤生长。描述了MAT2A抑制MTAP缺失的癌细胞的生物学后果，包括基因型选择性影响细胞内PRMT5活性和mRNA剪接，最终导致细胞周期缺陷和增殖减弱。因此，靶向MAT2A治疗MTAP缺失的癌症是一种合成致死率的成功应用，也是一种潜在的治疗方法，可以治疗大量周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白2A (CDKN2A)/MTAP位点缺失的患者。
基于细胞活性的MAT2A的抑制剂设计
PRMT5是一种甲基转移酶，在MTAP缺失的癌细胞中，由于其生化特性，该酶对SAM的减少特别敏感，其对MTAP底物MTA的亲和力要高于自身底物 SAM很多。因此，研究人员测试了对MAT2A的药理抑制是否会通过MTAP缺失基因型选择性的方式损害PRMT5活性。经AGI-24512处理后，在MTAP -/-和WT细胞中评估PRMT5依赖的对称二甲基精氨酸(SDMA)标记的水平。与先前的结果一致，MTAP -/-细胞中基础SDMA水平显著降低；还观察到MTAP抑制后SDMA水平显著降低。AGI-24512处理导致MTAP -/-中SDMA标记进一步减少，但WT细胞中没有。此外，在WT细胞中MTAP的药理抑制与MAT2A抑制协同作用，显著降低了SDMA标记。定量测定的剂量反应研究显示，AGI-24512对MTAP -/-细胞中PRMT5介导的SDMA标记的抑制IC50为95 nM，这与在这些细胞中观察到的细胞生长抑制的100 nM IC50有关。
相比之下，使用与SAM非竞争性PRMT5抑制剂EPZ015666治疗，无论MTAP状态如何，SDMA标记的剂量依赖性降低。因此， MAT2A抑制剂在细胞水平上诱导了对PRMT5活性的无MTAP基因型选择性抑制效应，迄今为止，在PRMT5的药理抑制剂中还未观察到这种效应。
AGI-24512在体外阻断MTAP缺失的癌细胞增殖
AGI-24512对MTAP -/-和WT细胞生长的影响采用基于ATP的增殖读数和延时成像进行监测。AGI-24512抑制了MTAP -/-细胞的生长(处理96 h后的IC50为100 nM)，而对WT细胞无显著影响。此外，MTAP在WT细胞中的药物学抑制导致了MTA的积累，并通过AGI-24512使细胞对抗增殖作用敏感。与之前的PF-9366结果一致，我们观察到AGI-24512治疗后MAT2A蛋白的上调。值得注意的是，这种通路反馈机制并没有阻止AGI-24512的抗增殖活性。研究人员提出假设，AGI-24512相对于之前的MAT2A抑制剂的效力提高，使AGI-24512能够在这种细胞适应的情况下保持抗增殖作用。
因此，AGI-24512选择性地减少了MTAP -/-癌细胞的生长，证实了使用靶向MAT2A的基因工具的观察结果，表明通过药物抑制MAT2A酶的功能是一种可行的治疗方法。接下来，研究人员在316种不同肿瘤来源的细胞系中探讨了AGI-24512的抗增殖作用。AGI-24512抑制了大多数MTAP缺失株系的增殖，但对大多数MTAP WT株系的影响有限。
虽然这些数据表明AGI-24512介导的SDMA标志物的抑制和癌细胞生长可能是靶向的，但研究人员通过产生耐药细胞来进一步完善AGI-24512的抗增殖作用机制。用增加剂量的MAT2A抑制剂治疗MTAP缺失的细胞10周，导致耐药群体的出现。该群体的基因组测序显示MAT2A中存在A276V点突变。外源表达A276V在未处理过的 MTAP -/-细胞中表明AGI-24512的作用是通过抑制MAT2A介导的。AGI-24512未能降低A276V MAT2A表达细胞的SDMA水平，说明AGI-24512通过抑制MAT2A来影响PRMT5介导的SDMA标志物下降。耐药A276V突变位于MAT2A变构结合口袋，表明它可能破坏药物-酶复合物的形成。
MAT2A抑制剂可在体内阻滞MTAP缺失的癌细胞生长
对AGI-24512药代动力学特性的初步评估表明，其口服吸收差，体内半衰期短。因此，研究人员根据AGI-24512的结构设计和优化生成了AG-270，这是一种口服生物可利用的、代谢稳定的、易于在体内工作的MAT2A抑制剂。AG-270可有效降低细胞内SAM，具有MTAP -/-选择性抗增殖活性，并降低SDMA标记，IC50分别为50 nM和35.3 nM。用AG- 270口服治疗动物可导致HCT116异种移植瘤持续高水平暴露，相应的SAM水平降低，且耐受良好。为了检测MTAP缺失肿瘤是否对体内抑制MAT2A的抗增殖作用敏感，研究人员每天给皮下移植MTAP -/-细胞的小鼠口服AG-270。治疗导致MTAP -/-异种移植肿瘤生长显著减少 (肿瘤生长抑制[TGI] = 75%， p <0.01)，耐受性良好，所有动物体重减轻均<20%。相反，在WT异种移植肿瘤小鼠中没有观察到抗增殖作用。AG-270在两种移植瘤模型中导致类似程度的SAM降低，这支持了一个假说，抑制MAT2A时，对MTAP缺失的选择性是因为对SAM的依赖增强而不是SAM产量的差异。此外，AG-270治疗降低了MTAP -/-肿瘤中的SDMA标记，而在WT肿瘤中影响甚微。
为了进一步探索AG-270对体内肿瘤生长的影响，研究人员研究了一组来自多种肿瘤组织学类型的患者来源的异种移植(PDX)模型。PDX模型在免疫缺陷动物中生长，建立的肿瘤用200 mg/kg AG-270治疗，在同基因型的HCT116在体内研究中这个剂量显示了最大的在靶性。药物治疗耐受性良好，组织学上显示多种来源的MTAP缺失的PDX模型的肿瘤生长减少，持续高药物暴露和肿瘤内SAM水平降低。在非小细胞肺癌(NSCLC队列)中，MTAP WT和MTAP缺失基因型的PDX模型的可用于评估MTAP状态和体内抗增殖活性程度之间的相关性。该分析显示，与体外数据相似，相比于MTAP WT 的NSCLC PDX肿瘤，AG-270可以更大程度抑制MTAP缺失的NSCLC PDX肿瘤，尽管肿瘤内SAM水平降低水平相当。重要的是，通过免疫组化定量分析，对AG-270治疗的NSCLC模型中PRMT5活性的分析突出了MTAP缺失模型中PRMT5依赖的SDMA水平的选择性影响。这为应用MAT2A药物调节PRMT5细胞活性而引起对MTAP缺失的选择性效应的观察提供了体内应用的概念证据。
抑制MAT2A导致MTAP -/-基因型选择性的细胞周期延迟和DNA损伤
这些细胞周期的改变伴随着染色体水平的DNA损伤，这可以从AGI-24512处理后微核的形成和双核和多核细胞的出现看出。细胞的多核出现和微核形成均局限于MTAP -/-细胞，而不存在于WT细胞。增殖率降低、p53激活和染色体异常细胞的积累表明AGI- 24512治疗触发了DNA损伤反应(DDR)。为了评估DDR诱导，研究人员分析了磷酸化的H2AX (γH2AX)点的形成，作为双链DNA断裂的标记。发现AGI-24512处理MTAP -/-细胞后，与DMSO对照和WT细胞相比，γH2AX阳性细胞显著增加。
接下来，研究人员试图识别抑制MAT2A时DNA损伤的触发因素。PRMT5的活性被认为可以调节RNA/DNA杂交结构(称为R环)的水平，最终导致细胞DNA损伤。研究人员使用高通量免疫荧光分析R-环特异性S9.6抗体，在MTAP -/-细胞中检测到AGI-24512处理后R-环核信号强度显著增加。RNAse H是真核生物中去除R环的主要调控因子。研究人员构建了RNAse H1的过表达稳转株，并观察到其蛋白水平上的过表达，显著减少了AGI-24512处理的MTAP -/-细胞γH2AX灶的形成，而在催化失活突变体D145N无此表型，表明R-环的形成是抑制MAT2A诱导的DNA损伤所必需的。
总的来说，这些数据表明，R-环在AGI-24512治疗后积累，导致DNA复制率降低和DNA损伤。
抑制MAT2A导致PRMT5下游RNA剪接的大量改变
在MTAP缺失的癌症中，抑制MAT2A导致PRMT5甲基转移酶活性降低 。PRMT5甲基化了剪接复合体的多个组成部分，据报道，PRMT5抑制可导致剪接异常。因此，研究人员对MAT2A抑制剂处理的细胞进行了RNA测序，以测量基因表达变化和检测剪接变化，发现AGI-24512在MTAP -/-中影响多个选择性剪接事件，但在WT细胞中不影响。
当多种形式的剪接在MAT2A抑制剂治疗后受到干扰时，观察到含有滞留内含子(DI)的转录本显著增加。这与最近的报道一致，这些报道表明，包括DIs在内的各种剪接事件都受到PRMT5活性的重度调控，并表明MAT2A下游的异常剪接可能影响蛋白的表达，因为含有DI的转录本被保留在细胞核中，因此不能有效翻译。AGI-24512治疗后，大部分扰动的DIs均上调，包括一些参与DNA修复的基因。蛋白质组学分析显示，在MTAP -/-细胞中，AGI-24512处理显著下调了参与DDR的几个通路。效应通路分析发现范可尼贫血(FA)通路受到高度影响，包括FANCL、FANCA和FANCD2水平降低，但FANCI没有。为了确定DI转录本的积累是否驱动了FA通路蛋白的变化，研究人员进行了qRT-PCR，结果显示含DI转录本的FANCL和FANCA转录本上调，而FANCL和FANCA mRNA的总水平降低，在抑制MAT2A或直接抑制PRMT5的情况下观察到；还通过western blot证实了一些FA通路里元件蛋白的减少。
重要的是，在AGI-24512或EPZ015666处理的细胞中，诱导的RNAse H1过表达并不能修复基于FANCA和FANCD2表达缺失的剪接缺陷。这表明，这种抑制MAT2A的剪切缺陷作用不是R环诱导的DNA损伤的结果，而是由MAT2A/ PRMT5依赖的剪接和DI调控驱动的。这些数据表明，AGI-24512处理不仅会触发DNA损伤，还会影响细胞修复DNA的能力，而这两种情况都是通过影响PRMT5活性来发生的，导致R-loop积累和剪接扰动。
体内PDX研究证实了DNA损伤失调是MAT2A抑制驱动机制的一部分
在之前大规模PDX体内研究中，对MAT2A抑制剂的敏感性分析显示，一些模型比其他模型表现出更好的反应。接下来，研究人员评估了PDX模型的全外显子组二代测序数据，以确定MAT2A抑制敏感性的潜在额外遗传决定因素。该分析显示，一些最敏感的模型在FANCI基因中携带突变，并且在某些情况下伴有第二等位基因杂合性的缺失。考虑到关于体外工具化合物AGI-24152对FA复合成分的影响，这一发现很有趣。
与体内反应增强相一致，与亲本对照相比，在MTAPi共同作用下，缺乏FA通路活性的FANCI KO HAP1细胞对AGI-24512表现出更高的敏感性。与此同时，AGI- 24512和MTAPi处理的HAP1 FANCI KO细胞中微核形成、γH2AX阳性和多核的细胞比例增加，证明导致了更严重的DNA损伤和有丝分裂缺陷。对FANCI KO细胞中pH3 S10染色的评估清楚地表明，MTAPi和AGI-24512共同处理后，染色体分离和染色体桥连接失败。因此，尽管AGI-24512对R-loop积累和DNA损伤诱导的影响是FA独立的，由于干扰剪接和DI导致FA复合物活性的部分丧失，特别是在LOF遗传背景下FA完全失活(FANCI KO, FANCI LOF突变)，可能与MAT2A抑制诱导的DNA损伤共同作用，导致损伤修复不足和生长缺陷增强。
因此，额外的DDR通路成分可能在抑制MAT2A时发挥抗增殖活性的作用。
AG-270与紫杉烷的合理联合用药策略
前文已经证明在MTAP缺失的模型中，药物抑制MAT2A酶的功能是一种可行的治疗方法，可产生体外和体内的抗增殖活性。因为联合方案的癌症治疗往往病人的收益更大，开始开发合理的联合治疗方法，最大限度地提高MTAP缺失肿瘤患者靶向MAT2A的疗效。
FA复合体除了在S期通过同源重组和R-环拆分的DNA损伤修复中发挥作用外，还在有丝分裂中发挥作用。最常见的FA通路中断成分FANCA的缺乏与抗有丝分裂紫杉醇治疗的敏感性增加相关。MAT2A抑制导致的FA通路成分水平降低可能对紫杉类标准治疗有类似的增敏作用。事实上，观察到FANCD2和FANCL KO HAP1细胞对多西紫杉醇和紫杉醇的敏感性增加。因此，研究人员先在体外测试了AG-270与紫杉烷的协同作用，并观察到组合指数<1，提示AG-270与多西紫杉醇以及紫杉醇之间存在协同作用，对MTAP -/-细胞具有选择性。在MTAP缺失(CDKN2A缺失)的胰腺癌细胞系KP4和通过MTAPi预处理转化为MTAP功能失活状态的H2122 NSCLC模型中也观察到协同作用。与预期的一样，AG-270降低了KP4细胞中FANCA和FANCD2的表达。此外，这与报告显示FANCA缺失导致紫杉醇治疗后磷酸化h3s10水平降低和多核形成一致，当AG-270与多西紫杉醇或紫杉醇联合用药时，使磷酸化的H3 S10减少，导致多核细胞数量增加，poly(ADP-核糖)聚合酶和caspase-3的裂解增加。
受AG-270和紫杉烷在体外协同作用的鼓舞，研究人员在NSCLC和食管鳞状细胞癌(SCC) PDX模型中进行了体内联合治疗研究。为了便于评估协同作用，所以选择了两个模型，这两个模型之前被确定为仅对MAT2A抑制具有中度敏感性。单独使用多西他赛(2.5或5 mg/kg)或AG-270 (100 mg/kg)疗效中等，但当两种药物联合应用于NSCLC和食道癌模型时，肿瘤完全停滞生长或衰退。还观察到AG-270和多西紫杉醇在体内KP4-K异种移植模型中的协同作用，以及在另一个胰腺组织学PDX模型中的强累加效应。在另一项单独的KP4-K模型研究中，对AG-270和多西紫杉醇之间的协同作用进行了类似的体内观察，有丝分裂缺陷的生物标志物显示AG-270/多西紫杉醇联合组中巨细胞增生和多核细胞的频率增加。因此，联合紫杉烷作为NSCLC、食管癌和胰腺癌的治疗标准，可能是对AG-270等MAT2A抑制剂的有效临床策略。
总结与展望
研究人员开发了一种新型MAT2A抑制剂，描述了其有效的细胞和体内活性的作用机制。在体外和体内，有效的MAT2A抑制在MTAP缺失的癌症中是耐受良好和有效的。因此，MAT2A抑制剂是研究生理和病理状态下，MAT2A和SAM的生物学功能的良好药理学工具，并且将MAT2A验证为生物标志物导向的临床试验的治疗靶点，用于大量MTAP缺失的癌症患者人群。基于这些发现，MAT2A抑制剂AG-270已进入临床开发阶段，目前一项I期试验正在招募MTAP缺失实体肿瘤和淋巴瘤患者(临床试验NCT03435250)。此外，基于已确定的驱动MAT2A抑制疗效的机制，提出了利用AG-270和紫杉烷之间的协同作用的合理联合方法可能是一种有效的临床策略。
参考文献
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