【人物与科研】华中师范大学尹军、刘盛华教授团队：谷胱甘肽特异性荧光探针应用于双通道生物成像

导语

谷胱甘肽（GSH）在生命体系中具有十分重要的作用。利用荧光探针与成像技术可视化标记生命体内的GSH对于深入了解GSH的功能具有重要意义。荧光信号作为荧光成像唯一的输出信号，其信号的多样性可以满足不同研究的需求。近日，华中师范大学化学学院尹军和刘盛华教授团队及其合作者清华大学深圳国际研究生院谭英教授、韩国梨花女子大学Yoon Juyoung教授，在荧光开、比例型荧光的基础上，进一步提出了双荧光开的信号模型，成功地开发出了第一个能够分别在可见光通道及近红外光通道均高特异性检测GSH的分子探针，并在双通道内用于活细胞及组织内GSH的荧光成像（Chem, 2018, 4, 1609-1628; Anal. Chem., 2019, 91, 11343-11348）。

尹军教授课题组简介

课题组一直从事有机荧光染料，光响应变色材料以及分子聚集与组装方面的研究工作。

尹军教授简介

华中师范大学化学学院教授、博士生导师。中国化学会和美国化学会会员。1998-2007年于华中师范大学本、硕、博连读获博士学位；2008-2010年在新加坡国立大学化学系从事博士后研究；2012-2013年在韩国梨花女子大学化学系作为研究教授从事科学研究。自2010年以来，在有机荧光材料、荧光传感、生物成像等方面开展了大量研究工作。先后主持承担了国家自然科学基金面上项目、青年项目，湖北省自然科学基金杰青项目、面上项目，武汉市科技晨光计划等多个项目。目前，担任国际期刊Chinese Chemical Letters青年编委、Current Smart Materials编委，是40多种国际期刊审稿人。以通讯作者或第一作者在Nat. Protoc., Chem, Chem. Soc. Rev., Coord. Chem. Rev., J. Am. Chem. Soc., Biosens. Bioelectron., Anal. Chem., Chem. Commun., Org. Lett., Chem. Eur. J., J. Org. Chem., J. Mater. Chem等国际权威杂志发表IF>3.0以上论文80余篇（他引次数4300多次，H指数为33，其中4篇入选高被引论文）。已申请中国发明专利4项、授权2项。

前沿科研成果

谷胱甘肽特异性荧光探针应用于双通道生物成像

谷胱甘肽（GSH）是一种含有活性巯基的三肽化合物，在生物系统内许多生理过程中发挥着关键作用。细胞内GSH浓度异常表达与多种疾病相关，可以作为衡量人类健康的重要生物标志物。然而，迄今为止开发的大多数GSH特异性荧光探针通过在单个通道中产生荧光开启信号来响应生物硫醇，荧光发射信号的变化通常基于单通道强度变化型和比率型这两种类型（图1A）。强度变化型单通道荧光探针容易受到光漂白、光散射以及溶剂极性、探针浓度、激发强度、仪器效率和环境条件变化等条件的限制，可能影响生物分析的准确性。相反，在两个发射通道中发生荧光信号变化的比率型荧光探针可以消除与测定条件变化相关误差的影响。然而，尽管它们利用双通道发射，但是目前的比率型探针通常产生“一边升”和“一边降”的荧光信号，容易引起光谱重叠、能量散射、自吸收等缺点。因此，研究开发能够产生多通道荧光信号以尽可能避免自吸收（能量传递）和信号相互干扰的新型检测模式，对于生物系统中的生物分析和生物成像具有重要意义。近日，华中师范大学尹军和刘盛华教授团队构建了一种新策略，来设计GSH响应的双通道荧光探针（DFP）（图1B）。团队设想在DFP存在下，利用双通道荧光信号来有效消除荧光信号采集过程中容易遭遇的自吸收和信号相互干扰等问题。  
图1. GSH响应单通道荧光探针（SFP）（A）和双通道荧光探针（DFP）的示意图（B）（来源：Chem, 2018, 4, 1609-1628） 在前期工作的基础上（J. Am. Chem. Soc., 2014, 136, 5351-5358; Nat. Protoc. 2015, 10, 1742-1754; Chem. Commun., 2016, 52, 721-724），团队进行合理设计，分别以萘酰亚胺和吲哚菁绿为可见光通道及近红外光通道荧光团，以磺酰胺为双荧光团链接基团，构建了一个双通道荧光探针CyP-SNp（图2A）。作者运用高斯09程序在B3LYP/6-31G*水平上进行含时密度泛函理论（TD-DFT）计算，结果表明探针CyP-SNp仅具有微弱荧光。因此，在GSH作用下，探针在可见光通道和近红外通道中的荧光开启将同步发生（图2B）。 
图2. 探针CyP-SNp的运行原理与前沿分子轨道示意图（来源：Chem, 2018, 4, 1609-1628） 作者选择三种小分子生物硫醇（GSH、Hcy和Cys）以及多种氨基酸作为检测客体，对探针CyP-SNp的体外光谱学性质进行了研究。结果表明，在可见光通道与近红外光通道内，该探针均能高特异性地响应GSH（图3A），且在两个通道中对GSH的检测几乎不受其它氨基酸的干扰（图3B）。 
图3. 探针CyP-SNp在可见光通道和近红外通道内的选择性实验（A）和竞争性实验（B）（来源：Chem, 2018, 4, 1609-1628） 取代产物1,8-萘酰亚胺衍生物Np-GSH可以作为双光子荧光团，因此作者对探针CyP-SNp以及其与GSH反应后的可见光发射产物 Np-GSH的双光子吸收特性进行探究。结果表明探针CyP-SNp具有优异的双光子性能（图4）。 
图4. 探针 CyP-SNp与可见光发射荧光产物 Np-GSH的双光子性质测试（来源：Anal. Chem., 2019, 91, 11343-11348） 基于良好的体外测试结果，作者随后将探针CyP-SNp应用于细胞内GSH的荧光成像。结果表明探针CyP-SNp能够渗透到细胞中并与细胞中GSH反生反应，生成可辨别的绿色荧光信号（来自取代产物 Np-GSH）和红色荧光信号（来自硫解产物CyP）。此外，探针CyP-SNp可用于细胞内源性GSH在绿色通道和红色通道中的同步荧光成像（图5）。 
图5. 探针CyP-SNp在绿色通道和红色通道中对内源生物硫醇的细胞成像和细胞内荧光信号的共定位实验（来源：Chem, 2018, 4, 1609-1628） 作者接下来探讨了探针CyP-SNp在活体系统中是否仍对GSH具有特异性。相同条件下，只有加入GSH的实验组才在绿色通道和红色通道中都产生明亮的荧光信号。结果表明探针CyP-SNp可应用于特异性监测细胞内GSH水平（图6）。


图6. 探针CyP-SNp在绿色通道和红色通道中对GSH响应的细胞成像（来源：Chem, 2018, 4, 1609-1628）
阳离子花菁IR-780染料结构中阳离子的正电荷对细胞线粒体膜的负电位具有电荷吸引，因此作者对含有阳离子结构单元的探针CyP-SNp的线粒体成像能力进行了验证。结果表明探针CyP-SNp在可见光通道内的绿色荧光信号和近红外通道内的红色荧光信号中都具有靶向线粒体中内源性GSH的能力（图7）。

图7. （A）探针CyP-SNp在红色通道的荧光信号和商品化线粒体绿色定位探针MitoTracker Green的共定位荧光成像；（B）探针CyP-SNp在绿色通道的荧光信号和商业化线粒体红色定位探针MitoTracker Red的共定位荧光成像（来源：Chem, 2018, 4, 1609-1628） 随后，作者继续使用商品化线粒体红色定位探针MitoTracker Red作为参比，同步地在两个通道中对探针CyP-SNp进行共定位实验。结果表明探针CyP-SNp在两个不同通道内的荧光信号能够同时特异性标记活细胞中的亚细胞器线粒体，成功实现活细胞内同一亚细胞器在两个完全不同的荧光通道内的同步荧光成像（图8）。

图8. 探针CyP-SNp在绿色通道和红色通道中与商业化线粒体红色定位探针MitoTracker Red的同步共定位实验（来源：Chem, 2018, 4,1609-1628） 作者利用探针CyP-SNp在可见区域的双光子发射和近红外区域的单光子近红外发射特性，将HepG2细胞或HeLa细胞与探针CyP-SNp共孵育后，在810 nm双光子激发下的可见光通道中观察到明亮的绿色荧光信号，在633 nm单光子激发下的近红外通道中也显示出明亮的红色荧光（图9）。上述结果表明探针CyP-SNp具有可见光通道中的双光子荧光成像能力和近红外通道中的单光子荧光成像能力。
图9. 探针CyP-SNp的在可见光通道内的双光子成像与近红外通道内的单光子成像。（A）HepG2 细胞；（B）HeLa 细胞（来源：Anal. Chem., 2019, 91, 11343-11348） 与传统的单光子可见光荧光成像相比，双光子荧光成像和近红外荧光成像具有更深层组织穿透性的优点。因此，作者通过将新鲜制备的小鼠肝组织切片与探针CyP-SNp共孵育以进一步深入研究探针的组织成像能力。结果表明探针CyP-SNp能够应用于可见光通道中的双光子组织成像和近红外通道的组织成像，实现在两个完全不同的通道中对细胞内源性GSH的双通道组织成像（图10）。 
图10. 探针CyP-SNp对小鼠肝组织中的GSH在可见光通道中双光子荧光成像（A）与近红外通道中的单光子荧光成像（B）  （来源：Anal. Chem., 2019, 91, 11343-11348） 作者利用探针CyP-SNp的近红外发射的优势，将探针CyP-SNp通过尾静脉注射入小鼠体内，然后通过小动物活体成像系统将其应用于可视化活体动物中的GSH。活体实时成像结果和离体器官成像结果表明探针CyP-SNp能够在活体内监测GSH（图11）。

图11. 小鼠活体荧光成像（来源：Anal. Chem., 2019, 91, 11343-11348） 上述研究清楚地表明探针CyP-SNp在两个完全不同的通道均能高特异性响应GSH。为了深入了解探针CyP-SNp对GSH具有高选择性的反应机制，作者进行了一系列研究（图12）。结果表明，虽然能够与其它两种生物硫醇（Cys和Hcy）进行相同类型的化学反应，但探针CyP-SNp显示出对GSH的突出特异性，这是由于这些反应速率的差异而引起的。

图12. 探针CyP-SNp与GSH、Cys和Hcy响应的可能反应机理（来源：Chem, 2018, 4, 1609-1628） 总结：该工作报道了一个双通道谷胱甘肽（GSH）荧光探针。该探针在可见光通道与近红外通道内均能高特异性地响应GSH。同时，探针在可见光通道内的绿色荧光与近红外光通道内的红色荧光能够同时特异性标记活细胞中的亚细胞器线粒体，成功实现活细胞内同一亚细胞器在两个完全不同的荧光通道内的同步荧光成像，为今后发展具有高时空分辨荧光成像功能的有机荧光染料奠定了基础。此外，探针可以在两个完全不同的通道中同步追踪组织的GSH，有助于研究GSH在活体水平中的生理功能。该研究工作对于GSH相关疾病的预防与临床早期诊断在荧光检测方面提供了新的思路。 相关研究成果近期分别以“A Visible and Near-Infrared, Dual-Channel Fluorescence-On Probe for Selectively Tracking Mitochondrial Glutathione”为题发表在Cell姊妹刊Chem上（Chem, 2018, 4, 1609-1628）（论文作者：Zhiqiang Xu, Xiaoting Huang, Xie Han, Di Wu, Bibo Zhang, Ying Tan, Meijiao Cao, Sheng Hua Liu, Jun Yin, and Juyoung Yoon），以及以“Tissue Imaging of Glutathione-Specific Naphthalimide-Cyanine Dye with Two-Photon and Near-Infrared Manners”为题发表在Analytical Chemistry上（Anal. Chem., 2019, 91, 11343-11348）（论文作者：Zhiqiang Xu, Xiaoting Huang, Ming-Xing Zhang, Weijie Chen, ShengHua Liu, Ying Tan, and Jun Yin）。两篇论文的第一作者均为课题组徐志强博士（目前就职于武汉工程大学化工与制药学院）。该工作得到了国家自然科学基金面上项目、湖北省自然科学基金杰青项目、面上项目和武汉市科技晨光计划等项目的大力支持。

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Chem, 2018, 4, 1609-1628

Anal. Chem., 2019, 91, 11343-11348

关于人物与科研

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