【材料】中科院化学所王健君研究员团队JACS：仿生控冰材料在组织器官冷冻保存中的应用
导语
组织器官是在器官移植、生育力保存、新药研发和疾病发病机制研究等领域具有重大医学及科研价值的珍贵生物样品（图1a）。当前组织器官主要采用零上（0~8 ℃）静态冷藏的方式短时间保存（2-4 h），由于保存时间短，捐献心脏、肺脏废弃率高达70%-80%（图1b）。而冷冻保存是实现组织器官长期保存，降低其废弃率的唯一有效手段。控制冰晶的形成和生长是实现组织器官冷冻保存必须要解决的问题。
图1.（a）组织器官在众多医学及科研领域的应用，（b）冷冻保存是降低组织器官废弃率的有效手段。
在过去的几十年里，尽管组织和器官的低温保存一直是人们追求的目标，但取得的进展有限。一个关键的原因是目前用于细胞冷冻保存的冻存保护剂（CPAs）具有细胞毒性，对组织结构有破坏作用，并且对冰晶生长的抑制作用有限，无法有效用于组织和器官冻存。因此，开发具有良好生物相容性和高效控冰能力的冷冻保护剂，是实现组织器官冻存的必由之路。近日，中科院化学所王健君研究员团队以“Bioinspired Ice-Binding Materials for Tissue and Organ Cryopreservation”为题在Journal of the American Chemical Society发表了展望性文章（DOI: 10.1021/jacs.2c00203）。
王健君研究员简介
王健君研究员，中国科学院化学研究所博士生导师，主持国家杰出青年科学基金项目与重点项目等。中国科学院分子科学中心第五届学术委员会委员；中国化学会第十三届理事会高分子学科委员会委员。《高分子学报》编委；韩国高丽大学冰水研究中心顾问。王健君研究员长期致力于控冰材料的基础及应用研究，在冰晶成核与生长的分子机制、防覆冰涂层材料的设计和应用、仿生控冰新材料的创制及其在细胞/组织冻存中的应用等方面取得了一系列创新性研究成果：首次在实验上探测到瞬间存在的纳米临界冰核，证实了百年前吉布斯的预言；明确了纳米粒子尺寸与冰晶成核温度的相互关系；揭示了高效控冰材料的分子机制。在防覆冰涂层材料和仿生控冰冻存材料领域申请了系列专利包，包括PCT发明专利9项，中国发明专利60余项，已获授权发明专利20余项。近五年论文发表在Nature、Nat. Commun.、Angew. Chem.、PNAS、JACS及Sci. Bull.等国际期刊上。研究工作被Nature、Nature Materials、BBC News、Newscientist、Academic Times及CCTV等亮点报道。
前沿科研成果
仿生控冰材料在组织器官冷冻保存中的应用
1. 自然界中的耐寒生物为组织器官冻存提供了新思路
自然界中极地、高原、沙漠等酷寒地区，有很多耐寒生物（图2a）：南极鱼类在-1.9 ℃的海水中依旧活跃；生活在北极圈附近的短翅甲虫可以在低至-55 ℃的环境中存活；阿拉斯加树蛙体内2/3对水分会在冬天结冰，但其复苏后仍可维持正常的生理功能；松树柏树等常青树木，即使在严寒的冬日仍维持着正常的代谢。冰结合蛋白（ice-binding proteins, IBPs）被认为是耐寒生物调节体液冰点以及冰晶生长的重要物质（图2b，2c）。
图2.（a）南极鱼类、阿拉斯加树蛙、耐寒昆虫以及松树等生活在自然界的耐寒生物；（b）抗冻蛋白降低冰点的能力远远优于基于依数性原理的传统冷冻保护剂；（c）不同结构的抗冻蛋白和冰晶核蛋白。
研究这些IBPs在耐寒生物体内的保护机制，开发新型仿生控冰冻存材料（Ice binding materials，IBMs），将为生物样品的冻存提供新的策略和方法。本文在简要介绍了组织器官冷冻保存时可能的损伤机制和传统CPAs在组织和器官低温保存方面面临的挑战之后，系统分析了抗冻蛋白在组织器官冻存中应用的优势和局限性，并展望了未来仿生控冰材料作为新一代CPAs用于组织器官冷冻保存的潜力和发展方向，为控冰材料的分子结构设计提供了新思路。
2. 抗冻蛋白在组织器官冻存中的应用
自1969年被首次发现后，IBPs曾一度让低温生物学家对实现大体积组织、器官冻存的目标充满了希望。研究证明这些尝试在一定程度上取得了成功，然而亦有研究称在某些情况下，IBPs的加入甚至会起到适得其反的作用。必须强调的是，IBPs与传统有机小分子冻存试剂相比，分子结构更复杂，可以引起的分子间作用力也更加多样。因此其在细胞、组织等复杂生物体系中可能引起的作用方式也更丰富多样。特别是考虑到生物样本本身成分的复杂性，细胞内液及胞间基质环境中往往充斥着各种各样的有机和无机的小分子和生物大分子，是一个高度拥挤的生物空间。因此，IBPs在组织器官等活性样品的冻存应用过程中必须要考虑的问题就是其与胞内、胞间成分的相互作用以及在这些拥挤的生物环境中的作用机制是否与体外稀溶液中的作用相一致（图3），这也是既往研究中常常忽略的一个重要问题。
图3. 仿生控冰材料（IBMs）在组织冻存中的应用必须依赖于对控冰蛋白（IBPs）在生物体内控冰机制的全面理解。
3. 针对性设计适合组织器官冻存的仿生控冰材料
考虑到IBPs本身结构与组织器官内部环境的复杂性。针对组织器官冻存的仿生控冰分子（IBMs），在具有良好生物相容性和控冰能力的基础上，仍需满足以下条件（图4）：（1）可控的聚集能力：这使得控冰分子在高度拥挤的组织环境中免于过度聚集而失效；（2）组织渗透性：仿生控冰分子向组织内部的渗透可以是组织在升降温过程中，即使存在温度梯度的情况下亦可抑制冰晶的过度生长，从而使大块组织器官免于冰晶损伤；（3）靶向性：大量的前期研究表明，即使生活在冰原上的昆虫和耐冻的阿拉斯加树蛙，其体内冰晶亦只在特定部位形成，而避免冰晶在某些对冰晶损伤较敏感的区域形成。因而，在明确组织器官对冰晶损伤敏感度的前提下，特定诱导冰晶的冰损伤钝感的区域形成，是保证组织器官冻存成功的另一个关键因素。
图4. 针对组织器官冻存的IBMs的分子设计及其在组织冻存中的应用。
总结：
组织和器官短缺是当今生物医学面临的最大危机之一，成功冷冻保存组织和器官可以大大降低它们的废弃率，极大地增加它们的利用率。因此，组织器官的冷冻保存已被欧美等许多国家列为优先发展的科研领域。虽然国内外科学家长期以来对组织器官的冷冻保存进行了不断的尝试和探索，然而存在冻存方法单一、评估手段断层的问题，急需研究范式的创新，以打破目前冻存成功率低、冻存试剂有效性和安全性差的困境。
组织和器官冷冻保存的关键挑战是高效调控冰晶的形成和生长，这是目前广泛应用于细胞冷冻保存的CPAs无法实现的。自然界生活在酷寒地区的耐寒生物可以通过分泌IBPs保护自身免受冰晶损伤，为解决组织和器官在冷冻保存中的冰晶损伤提供了一种独特的解决方案。随着对自然界耐寒生物控冰机制的逐步深入的理解以及越来越多的针对组织器官冻存的IBMs的创制，同时结合近年来快速发展的细胞、组织成像技术、基因测序、多组学等先进科学手段，通过多学科结合的团队的紧密合作，一方面探索冷冻保存方法的革新；另一方面，从结构和生理功能两方面，明确多个层次上组织在冻存前后的受损状态，形成系统的评估模式，既能反馈调节冻存条件，又能指导改善组织冻存后功能，相信组织器官的安全有效冻存将逐步从实验室走出，实现临床上的应用，引导医疗技术的变革。
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