【材料】四川大学蔡潇潇教授课题组Advanced Materials：动态DNA纳米盒实现siRNA的可控性包裹和释放

导语

通过siRNA精准调控靶基因的表达是近年来疾病治疗相关研究的热点方向。已表现出的显著治疗效果和仍存在的改进空间激励着大量研究团队的不断探索。siRNA应用的难点仍然是其递送效率的不足，包括难入胞性、酶降解、溶酶体逃逸等问题。四面体框架核酸 (tFNA) 作为一种3D的DNA纳米结构，基于其高效的自组装合成方式、尺寸的可控性和可定制式优化的多功能修饰等优势，在寡核苷酸递送中获得了广泛的关注，具有极高的研究和应用前景。

前沿科研成果

近日，四川大学华西口腔医学院蔡潇潇教授团队在Advanced Materials期刊上发表了题为“A Lysosome-activated Tetrahedral Nanobox for Encapsulated siRNA Delivery”的研究型文章（DOI: 10.1002/adma.202201731）。

该研究未采用常规粘性末端搭载目标siRNA，而是通过两端互补配对的方式将靶siRNA嵌入到载体内部，利用了tFNA固有的稳定空间提供保护作用。在保护性递送的基础上，进一步通过加入富C（Cytosine-rich）序列来增加pH响应性开关，使得该载体在进入细胞后可通过溶酶体的富氢离子特性将结构打开，从而获得目的siRNA的可控性释放。该动态DNA纳米盒独特的搭载方式能够显著提高被递送siRNA的抗酶降解和抗血清降解能力，并提供足够的“锁定”能力避免在递送过程中出现货物-载体意外分离。此外，该富C序列可以在溶酶体生理pH（约4.5-5.5）下，形成i-motif四链结构，使纳米盒从关闭状态转变为开放状态，配合37 ℃的生理温度驱动，最终实现siRNA主动释放。该研究对所设计的动态DNA纳米盒进行了细胞内追踪，从入胞、主动释放到溶酶体逃逸、细胞内siRNA的成熟前剪切，证实了所包裹搭载的siRNA能够突破从胞外到胞质内的多层屏障，最终实现靶mRNA的有效沉默。研究设计的tFNA边长为30 bp，可以容纳绝大多数siRNA的尺寸，能够为其他常规长度siRNA的沉默递送提供新思路，在小RNA递送系统领域具有广阔的前景。

（来源：Advanced Materials）

图1. 动态DNA纳米盒的设计与表征：（a）动态DNA纳米盒合成示意图；（b）2%琼脂糖电泳凝胶图；（c）5%PAGE结果通过荧光淬灭反应证实所搭载siRNA成功嵌入纳米盒的内部空间；（d）动态DNA纳米盒的溶酶体响应性开关示意图；（e）通过荧光淬灭反应证实开关在不同pH下的打开程度（pH = 8.0、7.0、6.0、5.5、5.0、4.5 和 4.0）；（f）对比动态DNA纳米盒（含有富C序列）和静态DNA纳米盒（对应随机序列，无pH响应性）在pH 8和pH 5条件下的结构变化。

（来源：Advanced Materials）

图2. 动态DNA纳米盒所包裹的siRNA的稳定性与释放能力评估：（a-f）评估了游离siRNA和动态DNA纳米盒搭载的siRNA对RNA酶A降解和血清降解的抵抗性。证实了嵌入性包裹的方式能够为siRNA提供明显的保护作用（g-j）对比动态DNA纳米盒（嵌入式搭载目的siRNA）和常规tFNA（黏性末端式搭载目的siRNA）在不同pH和不同温度下递送和控释能力。

（来源：Advanced Materials）

图3. 动态DNA纳米盒-siRNA在巨噬细胞内的轨迹追踪：（a-c）流式细胞术检测和分析游离siRNA以及常规tFNA、动态DNA纳米盒、Lipofectamine 3000搭载siRNA的入胞情况；（d-e）共聚焦显微镜下观察pH响应性开关在入胞后溶酶体内的打开情况（红色箭头指示没有Cy3信号重叠的单独Cy5信号；白色箭头指示伴随Cy3信号重叠的Cy5信号）；（f）共聚焦显微镜下观察孵育动态DNA纳米盒-siRNA 3小时、6小时、12小时和24小时后，巨噬细胞中siRNA的溶酶体逃逸情况（红色箭头指示尚未从溶酶体内逃逸的siRNA与溶酶体发生荧光信号的重叠，白色箭头指示已从溶酶体内逃逸的siRNA的Cy5信号）；（g）通过小RNA qPCR分析的游离siRNA以及常规tFNA、动态DNA纳米盒、Lipofectamine 3000搭载的siRNA在细胞内被剪切成为成熟siRNA后，siRNA正义链的相对水平。

（来源：Advanced Materials）

图4. 动态DNA纳米盒搭载抗TNFα-mRNA的siRNA在巨噬细胞中的基因沉默效果：（a）示意图显示了巨噬细胞内动态DNA纳米盒-siRNA发挥基因沉默作用的过程；（b-c）qPCR和ELISA分别从基因水平和蛋白水平分析了游离siRNA以及常规tFNA、动态DNA纳米盒、Lipofectamine 3000搭载的siRNA转染后，炎症状态下细胞内TNFα mRNA 表达水平以及TNFα的分泌水平；（d-e）荧光显微镜下观察巨噬细胞中活性氧的表达水平。

（来源：Advanced Materials）

图5. 动态DNA纳米盒搭载抗TNFα-mRNA的siRNA在小鼠体内的基因沉默效果：（a）小鼠腹腔注射动态DNA纳米盒-siRNA后，在不同时间（30分钟、1小时、2小时、3小时、6小时、12小时和24小时）进行体内荧光分布和离体器官的荧光图像拍摄；（b）C57BL/6 小鼠的血清、腹膜液和气管灌洗液内的TNFα蛋白水平；（c）组织器官（肝脏、脾脏和肺部）中TNFα 的mRNA水平；（d）肝脏内TNFα阳性细胞分布情况；（e）肝脏和血清中的ALT活性分析。
这些结果证实纳米盒的四面体结构为目的siRNA提供了显著的保护作用以及运输过程中的递送稳定性。此外，溶酶体响应的动态开关允许目的siRNA在生理温度下主动地可控地释放。体外实验和体内实验均实现了对靶标TNFα mRNA的优异的基因沉默效果。动态DNA纳米盒被认为可为siRNA用于疾病治疗提供一个动态的pH限制的递送系统，并且可以成为其他小RNA载体设计的可扩展思路。

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近期科研成果介绍：

[1] Li Songhang,Liu Yuhao,Tian Taoran et al. Bioswitchable Delivery of microRNA by Framework Nucleic Acids: Application to Bone Regeneration.[J] .Small, 2021, 17: e2104359.

[2] Zhou Mi,Gao Shaojingya,Zhang Xiaolin et al. The protective effect of tetrahedral framework nucleic acids on periodontium under inflammatory conditions.[J] .Bioact Mater, 2021, 6: 1676-1688.

[3] Sirong Shi,Yang Chen,Taoran Tian et al. Effects of tetrahedral framework nucleic acid/wogonin complexes on osteoarthritis.[J] .Bone Res, 2020, 8: 6.

蔡潇潇教授课题组简介

四川大学华西口腔医学院在读博士生高阳为该文章的第一作者，通讯作者为四川大学华西口腔医学院蔡潇潇教授（论文作者：Yang Gao, Xingyu Chen, Taoran Tian, Tao Zhang, Shaojingya Gao, Xiaolin Zhang, Yangxue Yao, Yunfeng Lin, Xiaoxiao Cai）。

课题组合照

蔡潇潇教授简介

蔡潇潇，女，教授，主任医师，博士生导师，科研工作主要从事口腔组织工程与核酸纳米材料研究；临床工作主要从事口腔种植学工作。发表第一/通讯作者SCI论著93篇（累积影响因子600），包括Advanced Materials、Small、Bioactive Materials、Bone Research等，封面论文11篇，ESI高被引论文3篇，最高影响因子30，影响因子＞10的7篇，影响因子＞6的57篇，主编英文专著2部，累计SCI他引3000余次，H-Index=32，担任Journal of Biomedical Nanotechnology（SCI）副主编，6本SCI期刊编委，担任International College of Dentistry Fellow。主编英文专著2部。主持国家自然科学基金5项。获得全国百篇优秀博士论文提名奖、四川省优秀博士论文、7次全国BITC种植病例大赛金奖等。

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