【有机】复旦大学雷祖海课题组JACS：第二近红外窗口聚甲炔平台分子用于构建比率型分子荧光探针

导语

近红外二区（NIR-II）荧光成像具有穿透深度深、光散射弱等优点已被广泛用于活体深层组织荧光成像。目前NIR-II区的荧光探针主要是“关-开”型探针，此类型荧光探针可以选择性被活体内的特定底物激活，从而给出信号，但它们只能实现“有”和“无”的信号改变，利用“关-开”型荧光探针可以实现对肿瘤微环境中特定底物如酶、ROS/RNS定性的可视化监测，但不能实现定量变化的监测。相比而言，比率型荧光探针由于可以通过多个通道采集信号再把各通道信号进行关联，具有自我校正功能，可以实现定量分析监测。但截至目前为止，NIR-II区比率荧光探针和探针设计策略都比较少，且能实现检测的底物种类以强氧化性物质为主，不能满足对酶等生物分子的检测需求。

近日，复旦大学雷祖海课题组设计了一种发射处于近红外二区的分子平台Py-2，该平台具有很好的普适性，基于此分子构建了两个比率型分子荧光探针并实现了对活体深层组织内酶、ROS/RNS等生物分子的可视化量化监测。作为平台分子，Py-2可以很方便的被开发成各种检测目的的NIR-II比率型分子荧光探针。相关研究成果以“Polymethine Molecular Platform for Ratiometric Fluorescent Probes in the Second near-Infrared Window”为题发表在JACS（DOI: 10.1021/jacs.2c10041）。论文第一作者为复旦大学博士后蓝庆春和博士生于朋，通讯作者为雷祖海青年研究员。通讯单位为复旦大学药学院。

图1.  比率型NIR-II探针的生物传感机理（来源：JACS）

前沿科研成果

作者结合罗丹明6G分子骨架与聚甲炔设计开发了发射光谱处于近红外二区的分子平台Py-2。为了验证作者所设计的Py-2分子平台的普适性，基于Py-2分别合成了响应硝基还原酶和响应ROS/RNS的比率型荧光探针Rap-N和Rap-R，两种探针对特定底物都表现出很好的比率荧光响应。在活体实验中，Rap-N实现了对不同肿瘤的硝基还原酶的半定量监测，Rap-R实现了对肝损伤和腹膜炎的活体实时半定量监测。该Py-2分子为NIR-II比率荧光探针的设计及体内生物传感提供了广泛的有吸引力的平台。
为了评估设计策略的可行性，作者首先进行了量子化学理论计算。结果表明，Py-2和酰化后的分子Rap-M具有近似的能隙和振子强度f值，表明它们可能具有不同的吸收光谱但具有类似的发射光谱性质，有潜力开发成比率荧光探针。进一步合成Py-2、Rap-M并测试发现：它们的最大吸收和发射波长分别为965/1010 nm、795/945 nm。作者进一步通过调节Py-2和Rap-M之间的比例来模拟比率荧光信号。作者使用实验室自己搭建的InGaAs装置，采集不同深度（1% Intralipid）下这些混合物溶液的900 LP和1000 LP荧光。定量分析结果表明：这两个通道的荧光信号衰减与穿透深度的增加同步，不同深度得出的比值保持稳定，表明在不同的穿透深度下比率信号是可靠的（图2）。

图2.  Py-2作为比率NIR-II荧光探针分子平台的可行性验证（来源：JACS）

为了证实作者设计的比率荧光策略的实用性，作者分别合成了响应硝基还原酶（NTR）和响应 ROS/RNS的比率型荧光探针Rap-N和Rap-R。体外光谱测试结果表明：这两种探针对特定底物都表现出很好的比率荧光响应（图3）。

图3. 比率荧光探针光谱测试（来源：JACS）

鉴于Rap-N探针在体外测试的高灵敏度和特异性，作者进一步研究了Rap-N实时显示体内NTR活性的能力。选择携带两个皮下4T1乳腺肿瘤的雌性BALB/c小鼠作为模型。作为对照，一侧4T1肿瘤部位用NTR抑制剂双香豆素（肿瘤1）预处理，其荧光信号比（F1000 LP/F900 LP）约为0.5，在双香豆素组（肿瘤1）中保持不变；另一侧在30分钟内（肿瘤2）达到约0.6，这与细胞成像结果一致。这些结果表明，Rap-N在肿瘤中可被NTR选择性激活。进一步比较不同肿瘤中的NTR活性，作者选择CT-26结肠肿瘤作为另一种肿瘤。原位注射Rap-N探针后，在4T1和CT-26肿瘤区域观察到显著的NIR-II荧光信号，然后在30分钟内逐渐增加到最大值。4T1肿瘤中的比率荧光信号（∼0.59）明显高于CT-26肿瘤（∼0.53），结果显示4T1肿瘤表现出比CT-26肿瘤更高的乏氧；免疫荧光染色结果也表明4T1肿瘤比CT26肿瘤更缺氧，双香豆醇可以有效抑制NTR的活性。

图4. Rap-N体内生物传感应用（来源：JACS）

总结与展望： 比率型荧光探针由于可以通过多个通道采集信号再把各通道信号进行关联，具有自我校正功能，可以实现定量分析监测。本文设计合成的比率型荧光分子平台Py-2可以很方便地被开发成各种检测目的的NIR-II比率型分子荧光探针，用于对活体深层组织内酶等生物分子的可视化量化监测。
该工作得到了复旦大学药学院、智能化递药教育部重点实验室、复旦大学化学系、复旦大学先进材料实验室、聚合物分子工程国家重点实验室、国家自然科学基金和上海市科委复旦大学启动经费的大力支持。

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雷祖海老师简介

青年研究员，博士生导师，自2012年起一直致力于高性能荧光染料和传感探针的研究。针对荧光活体成像中穿透深度浅和背景干扰的科学问题，在化学与生物传感领域做出了系统的工作，创制多个系列用于生物成像的高亮度、高稳定性荧光染料，提出“共价组装”零背景干扰传感探针设计策略，并开发了系列用于健康相关底物检测的零背景传感探针。以通讯作者和第一作者在国际权威期刊发表论文10余篇，包括Angew（5篇）、JACS（2篇）、Chem Sci（1篇）。获得中国授权专利3项，美国授权专利1项。作为课题负责人承担国家自然科学基金2项、上海市科委项目2项；入选博士后创新人才支持计划、上海市科技启明星计划。

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