【生化】西北大学和媛/曼彻斯特大学金轶ACS catalysis：细菌GH20糖苷酶特异性降解硫酸化糖链分子机制

CBG资讯 2023-03-20

The following article is from 枫林糖网 Author 和媛

N- 和O-聚糖的硫酸化修饰对维持糖链的生物学功能具有重要作用。N-乙酰基-D-葡萄糖胺 6-硫酸（6SO3-GlcNAc）常见于粘蛋白（Mucin）、人乳寡糖 (HMO) 和糖胺聚糖（GAG）等聚糖结构中。结肠粘蛋白上6SO₃-GlcNAc水平的变化可以改变粘蛋白的物理化学性质，并参与到炎症性肠病、结肠炎、克罗恩病、癌症和囊性纤维化等疾病的发生与发展过程中。鉴于硫酸化糖链重要的生物学功能，鉴定硫酸化糖链代谢相关的酶分子具有重要意义。

人类肠道细菌可以使用两种策略去除糖链的硫酸化修饰：一种依赖于硫酸酯酶（sulphatase）进行脱硫酸化；第二种依赖于sulfoglycosidase糖苷酶降解硫酸化糖。6S-GlcNAcase是细菌表达的一种sulfoglycosidase，负责切割寡糖末端的6SO3-GlcNAc基团。该酶属于carbohydrate-active enzymes中的GH20家族，通过“substrate-assisted catalysis”机理水解O-糖苷键。但是GH20家族中除了6S-GlcNAcase外，还包含exo-acting β-N-acetylglucosaminidases、β-N-acetyl-galactosaminidase和endo-acting lacto-N-biosidases。因为这些酶之间的氨基酸序列具有高度的相似性，仅通过生物信息学的方法无法将6S-GlcNAcase区分开来。因此，截至目前，人们对6S-GlcNAcase特异性识别硫酸化糖链的分子机制仍知之甚少。
2022年12月27日，西北大学和媛教授联合曼彻斯特大学金轶研究员在ACS Catalysis期刊上发表文章Mechanistic and Structural Insights into the Specificity and Biological Functions of Bacterial Sulfoglycosidases（DOI: 10.1021/acscatal.2c05405）。该工作通过结构生物学和酶学的手段，以双歧杆菌B. bifidum JCM1254中的 BbhII、多形拟杆菌 B. thetaiotaomicron中的Bt4394及普雷氏菌Prevotella RS2中的SGL这三种6S-GlcNAcase酶为研究对象，首次从分子水平揭示了其对硫酸化糖类底物的分子识别机制，并在此基础上通过生物信息学分析鉴定出更多具有类似酶功能的人体微生物。

成果简介课题组首先采用基因重组技术制备了BbhII酶，酶活实验表明BbhII可以特异性水解4MU-6SO₃-GlcNAc底物，其催化效率（k_cat/K_M）是 4MU-GlcNAc 底物的 2500倍。类似的，Bt4394和SGL酶也对硫酸化底物具有高度的选择性，而且这些酶分子对硫酸化糖的识别比对磷酸化糖高3个数量级。除了可以水解人工底物，LC-ESI-MS实验证明这些酶分子也可以释放猪胃粘蛋白上的6S-GlcNAc基团。为了进一步揭示这些6S-GlcNAcase的结构特征及其特异性识别硫酸化糖链的分子机制，研究人员采用X-射线单晶衍射的方法捕获到多个高分辨率复合物晶体结构。

BbhII_E553Q-6S-GlcNAc-oxazoline晶体结构指认了Q(X₁₀)WAC 序列中的Q₆₄₀和 W₆₅₁是BbhII酶对硫酸基团的识别位点。Bt4394_D335N-6S-GlcNAc-oxazoline 晶体结构揭示了 QIPYYINR 序列中的Q₄₃₁、N₄₃₇和R₄₃₈是Bt4394 酶对硫酸基团的识别位点。

基于上述信息，研究人员尝试采用genomic enzymology的方法鉴定出更多潜在的6S-GlcNAcase酶。首先使用EFI工具（https://efi.igb.illinois.edu/）生成了GH20家族蛋白质的序列相似性网络（SSN），然后使用HMMER服务器针对和BbhII、Bt4394位于同一个簇内的序列进行Uniprot数据库搜索，最终分别鉴定出和BbhII/Bt4394具有相同硫酸化糖分子识别位点的新序列共86个。进一步的chemically guided functional profiling (CGFP)分析显示表达这些6S-GlcNAcase酶的人类细菌大都存在于肠道和口腔相关宏基因组中，暗示这些生物可能参与到宿主及食物来源6SO₃-GlcNAc聚糖的代谢。
论文信息：[1] Zhen Zhang#, Mochen Dong#, Rémi Zallot#, George Michael Blackburn, Nini Wang, Chengjian Wang, Long Chen, Patrick Baumann, Zuyan Wu, Zhongfu Wang, Haiming Fan, Christian Roth, Yi Jin*, and Yuan He*. Mechanistic and Structural Insights into the Specificity and Biological Functions of Bacterial Sulfoglycosidases. ACS Catal. 2023, 13, XXX, 824–836. 原文链接：https://doi.org/10.1021/acscatal.2c05405。

课题组介绍

金轶，英国曼彻斯特大学（University of Manchester）化学系兼曼彻斯特生物技术研究所（Manchester Institute of Biotechnology, MIB）研究员、英国卡迪夫大学（Cardiff University）荣誉研究员，Wellcome Trust Sir Henry Dale Fellow获得者, 博士生导师，英国皇家化学学会特许化学家（Chartered Chemist）。2012年在英国谢菲尔德大学取得分子生物和生物技术博士学位（导师Jon Waltho和Michael Blackburn教授）；2014年至2017年在英国约克大学进行博士后研究（导师Gideon Davies院士）；2017年被英国卡迪夫大学化学学院聘为大学研究员PI；2021年加入英国曼彻斯特大学。金轶课题组专注于DNA修复酶以及和疾病、信号通路相关的糖生物学和磷酰化生物学、细菌抗生素耐药性等领域的研究，涉及有机合成、分子生物学、微生物学、大分子核磁共振、X-ray蛋白晶体学、非天然氨基酸引入等研究手段。现为Frontiers in Chemistry 和 Frontiers in Molecular Biosciences学术编辑、Frontiers in Medical Engineering副主编。

课题组主页：https://www.research.manchester.ac.uk/portal/yi.jin.html。

和媛，西北大学化学与材料科学学院教授，陕西省“百人计划”获得者。2011年博士毕业于英国约克大学（导师 Gideon Davies 院士），随后在加拿大 Simon Fraser University（David Vocadlo 教授实验室）和美国The Scripps Research Institute（Jim Paulson 教授实验室）进行博士后研究，2013年加入西北大学，现在是陕西省 “生物医用磁学纳米材料创新团队”核心成员。和媛教授课题组专注于酶/纳米酶相关的基础应用研究，近年在磁控酶及纳米酶催化（ACS Appl Mater Interfaces, 2021. 13(44):52395–52405；Nanoscale, 2019. 11(39):18081-18089；Sci China Life Sci, 2022. 65(1):184-192.）、酶促反应热动力学分析（Angew Chem Int Ed, 2018. 57(52):17120-17124；Biochim Biophys Acta Gen Subj, 2017. 1861(8):2031-2038.）等领域取得了系列重要成果。