JAFC：加拿大阿尔伯塔大学研究团队解密商业牛乳的化学成分

文献分享

编者按：

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2019年4月17日，加拿大阿尔伯塔大学在Journal of Agricultural and Food Chemistry（1区，IF：3.412）发表了题为“Chemical Composition of Commercial Cow’s Milk（商用牛奶的化学成分）”的研究论文，作者应用现代定量代谢组学技术和计算机辅助文献挖掘，以获得商业牛奶中化学成分的最全面和最新的表征。使用核磁共振（NMR）光谱，液相色谱-质谱（LC-MS）和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS），能够识别和量化296种牛奶代谢物或代谢物种（对应于来自各种商业牛奶样品的1447种独特结构）。通过文献分析，还发现了另外676种代谢物或代谢物种（相当于908种独特结构）。

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科学私享

2019.04.19

第一作者：Aidin Foroutan

通讯作者：David S. Wishart

通讯单位：加拿大阿尔伯塔大学

DOI：10.1021 / acs.jafc.9b00204

摘要

牛奶是一种营养丰富，化学复杂的生物流体，由数百种不同成分组成。虽然牛奶的化学成分已经研究了几十年，但这些信息中的大部分都是零碎的，非常过时。为了巩固和更新这些信息，作者应用现代定量代谢组学技术和计算机辅助文献挖掘，以获得商业牛奶中化学成分的最全面和最新的表征。使用核磁共振（NMR）光谱，液相色谱 - 质谱（LC-MS）和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS），研究能够识别和量化296种牛奶代谢物或代谢物种（对应于来自各种商业牛奶样品的1447种独特结构）。通过文献分析，还发现了另外676种代谢物或代谢物种（相当于908种独特结构）。关于牛奶中所有2355种已鉴定化学品的详细信息已通过名为牛奶成分数据库或MCDB的网络可访问数据库免费提供（http://www.mcdb.ca/）。

背景介绍

牛奶通常被称为“完美食品”。乳汁来自所有围产期雌性哺乳动物的乳腺，富含关键营养素，如碳水化合物，蛋白质，脂肪，矿物质和维生素，可动态调整以满足新生儿生长的特定发育需求。牛奶不仅在营养和水合作用中起着关键作用，它还在建立必需的肠道微生物群和在所有新生哺乳动物中引发免疫系统方面发挥着重要作用。虽然牛奶通常是属于该物种的幼小哺乳动物消耗的物种特异性生物流体，但人类独特地消耗其他物种产生的牛奶并继续消耗牛奶进入成年期。全球牛奶产量以5种动物为主，其中83％的奶产量来自奶牛，其次是水牛13％，山羊2％，绵羊1％，骆驼0.4％。人类从家畜中提取牛奶并将其食用到成年期的能力在农业的发展，公民社会的建立以及许多广泛使用的食品的开发中发挥了关键作用。事实上，收集和使用牛奶的能力对于过去一万年来人类的健康，成长，迁徙和成功至关重要。即便在今天，牛奶仍是世界上消费最广泛的饮料之一（2017年生产的牛奶为8.11亿吨）。它不仅可作为液态奶，还可作为调味牛奶，冰淇淋，奶酪，黄油，酸奶，酪蛋白粉和许多其他乳制品的原料。鉴于牛奶，特别是牛奶的重要经济和营养重要性，了解牛奶多年来一直是详细的化学或营养分析的主题并不奇怪。这些包括对牛奶维生素，矿物质，脂肪，蛋白质，（10）和碳水化合物的综合研究。在常量营养素水平，牛奶通常由水（85-87％），脂肪（3.8-5.5％），蛋白质（2.9-3.5％）和碳水化合物（5％）组成。在微量营养素水平，牛奶含有许多生物活性化合物，包括维生素，矿物质，生物胺，有机酸，核苷酸，低聚糖和免疫球蛋白。这些化合物的确切性质和相对丰度是许多内部和外部因素的函数。这些因素包括母牛乳房组织内的代谢活动，一般乳房健康状况，给予母牛的饲料类型，母牛瘤胃液中某些微生物的活动和丰度，以及微生物活性和酶活性。原料奶中发生的反应。牛奶成分也随着牛品种（即荷斯坦奶牛，泽西岛，布朗瑞士奶牛等），哺乳期，平价水平，可存活妊娠次数，牛奶质量控制和采奶后的加工程序而变化。

历史上，大多数牛奶成分研究都是使用目标化学分析进行的，旨在表征特定类别的化合物（即仅糖，仅脂肪）。虽然有针对性的分析方法非常准确，但它们需要相当多的技能，其化学范围相当有限，并且通常需要大量的时间和手动工作。随着定量，靶向代谢组学方法的发展，有可能实现更全面的食品，生物流体和组织的化学覆盖。代谢组学是“组学”科学的一个分支，涉及大量小分子代谢物的高通量，全面表征。由于质谱（MS）和核磁共振等分析技术的重大进步，代谢组学方法能够常规地从单个样品中鉴定和定量数百种化合物。实际上，代谢组学已经能够确定一系列生物，细胞类型和生物流体的小分子代谢物的广泛清单。

在过去的10年中，对牛（和其他牲畜）牛奶样品进行了几项全面的代谢组学研究。Boudonck等人的研究。使用液相色谱 - 串联质谱（LC-MS / MS）的组合鉴定（但不幸的是没有量化）93种牛奶代谢物，包括氨基酸，短肽，碳水化合物，脂质，维生素，核苷酸和酶辅助因子）和气相色谱 - 质谱（GC-MS）。在Klein等人的后续研究中，结合NMR和LC-MS观察两种奶牛品种Brown Swiss和Simmental在泌乳早期和晚期之间牛奶的化学成分如何变化。这些作者确定并量化了44种牛奶成分，包括许多氨基酸，糖，脂肪酸和有机酸。Yang等人完成了来自不同奶牛（中国荷斯坦奶牛，泽西岛，牦牛，水牛，山羊，骆驼和马）的奶的比较代谢组学研究。本研究使用NMR和LC-MS比较了中国荷斯坦牛和泽西牛与其他奶牛的牛奶代谢物谱。结果显示，在荷斯坦奶牛和泽西岛，水牛，牦牛，山羊，骆驼和马产生的牛奶中，68,74,54,58,77和91代谢物的子集分别显着不同。不幸的是，该研究未提供已鉴定的代谢物或其测量浓度的列表。在最近由Mung和Li报道的代谢组学研究中，使用化学同位素标记LC-MS技术在牛奶中推定了超过2500种代谢物。然而，少于80种化合物被阳性鉴定，并且没有化合物实际上被量化。O'Callaghan等人描述了对牛乳进行的最新定量代谢组学研究。这些作者使用核磁共振光谱法来确定不同饲喂系统中牛奶的化学成分如何变化。该研究导致49种牛乳代谢物的鉴定和定量。

如上所述，已经进行了许多研究牛奶组合物的研究，但是没有人试图使用两种以上的分析技术来全面地鉴定和定量牛奶。此外，许多这些研究尚未公布其报道的实验结果。此外，这些代谢组学研究都没有试图整合先前公布的牛奶成分信息，以扩展或验证其结果。

为了进一步研究牛奶化学和牛奶微量营养素，作者认为使用多种全定量代谢组学技术全面描述牛奶的化学成分至关重要。这样的事业将使牲畜研究人员，食品科学家，营养学家和消费者受益，因为它将创建一个集中的，全面的，可电子访问的数据库，其中包含牛奶中发现的所有检测到的或可检测的代谢物/化学物质。为了创造这样的资源，作者将实验代谢组学技术与计算机辅助文本挖掘相结合，以编译可以在牛奶中检测到的基本上所有已知的化学物质（内源性和外源性）以及它们各自的浓度。实验上，使用多种定量代谢组学技术，包括高分辨率核磁共振光谱，液相色谱结合高分辨率质谱（LC-HRMS），LC-MS / MS和ICP-MS方法来鉴定，定量和验证296牛乳代谢物或代谢物种（对应于1316脂质和131种非脂质）。为了进一步加强我们的代谢分析研究，进行了广泛的文献调查，并通过计算机辅助文献检索确定的近150篇期刊文章中提取代谢物数据。这种“参考文献”的产生了另外676种代谢物或代谢物种类的数据（其对应于292种脂质和616种非脂质）。由此产生的数据现在存放在牛奶成分数据库（MCDB）中，这是一个包含浓度数据的综合网络可访问来源，物理化学数据和972种代谢物或代谢物种的参考数据，相当于牛乳中发现的2355种独特的化合物结构。在这里，将“代谢物种”定义为具有非独特化学式或质量（例如脂质）的分子，而“独特的化合物结构”对应于具有独特且明确定义的化学结构和独特化学名称的化合物。

总体而言，本研究的目的是帮助消费者，牛奶生产商，营养化学家和乳品研究界解决四个关键问题：（1）牛奶中含有哪些化合物和营养素？（2）不同商品牛奶中代谢物浓度的近似变化是多少？（3）使用有针对性的定量代谢组学技术可以鉴定和/或量化哪一部分乳代谢组？（4）哪种分析方法（NMR，LC-HRMS，LC-MS / MS，ICP-MS）最适合全面分析牛奶？回答这些问题将为正在进行的和未来的牛奶成分研究提供一个共同的基础和更合适的基线。

研究方法

（1）牛奶样品收集

在该研究中分析了四种不同类型的市售牛脂，其具有不同脂肪含量。这些包括商业脱脂奶或脱脂奶（<0.2％乳脂），1％牛奶，2％牛奶和3.25％牛奶，所有这些都用维生素D 3强化。本研究中使用的所有商业牛奶样品均购自加拿大埃德蒙顿的当地超市。虽然没有关于奶牛确切类型或品种的详细信息，但加拿大西部绝大多数（> 95％）奶牛都是Holsteins。样品采集后，将1.0mL样品移液到1.5mL Eppendorf管中，并储存在-20℃的冰箱中直至分析时。通过四种不同的代谢组学技术分析总共16个乳样品（来自每种类型的乳的四个重复）。

（2）核磁共振波谱学

牛奶蛋白质和脂蛋白可以严重损害1H NMR光谱的质量，尽管产生强烈的宽谱线，干扰低丰度代谢物的鉴定和定量。去蛋白化可以消除这些高峰。根据先前报道的脱蛋白方法，使用3-kDa截止离心过滤器单元（Amicon Micoron YM-3; Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）通过离心和超滤进行乳样品的去蛋白化。

（3）NMR化合物鉴定和定量

在频谱去卷积之前，所有自由感应衰减（FID）都被零填充到240k数据点，并且应用了0.5Hz线加宽功能。添加的DSS的甲基单线态（设定为0.00ppm）既可作为内部化学位移参考标准，也可作为量化的内标。使用Chenomx NMR Suite 8.1软件包（Edmonton，Canada）处理所有1 H NMR光谱，如前所述进行定量。至少有两名经验丰富的核磁共振光谱仪处理和分析光谱，以消除化合物识别和定量误差。样品加标实验也用于证实NMR光谱中怀疑存在的许多化合物的特性。加标实验包括向选定的牛奶样品中加入50-500μM的假定化合物，以测试相应的1H NMR信号是否如预期的那样发生变化。所有牛奶样品也在多个时间段（第一次采集后最多24h）进行评估，以确保代谢物浓度没有显着变化。

（4）LC-HRMS化合物鉴定和定量

采用目标，完全定量的代谢物分析方法，将直接流动注射（DFI）-质谱与反相LC-HRMS相结合，以确定氨基酸，生物胺，单糖，酰基肉碱（AC），甘油二酯（DG）的浓度，牛奶样品中有甘油三酯（TG），磷脂酰胆碱（PC），溶血磷脂酰胆碱（LysoPCs），鞘磷脂（SM），神经酰胺（Cers）和胆固醇酯（CE）。这些分析是通过新发布的定量代谢组学试剂盒（Absolute IDQp400 HR），可从Biocrates Life Sciences AG（Innsbruk，Austria）获得。

（4）使用LC-MS / MS表征无乳脂肪酸

使用先前描述的LC-MS / MS方法分析商业乳样品中的游离脂肪酸，进行一些修改，包括3-硝基苯肼（NPH）衍生化步骤。同位素标记的13 C 6 -3 -硝基苯肼（用于衍生化和定量）购自Cayman Chemical（Ann Arbor，MI）。所有其他试剂和溶剂，包括所有脂肪酸标准品，均购自Sigma-Aldrich（Oakville，Canada）。

（5）使用LC-MS / MS表征乳维生素

通过目标LC-MS / MS方法分析牛奶中发现的水溶性和脂溶性维生素。在HPLC级水中制备每种上述水溶性维生素标准品（2mM）和同位素标记的标准品（3mM）的单独储备溶液。然后将各个标准储备溶液混合在一起以制备7种校准物，其浓度范围如下：维生素B 1为0.01至1μM ，维生素B 2，维生素B 6，维生素B 7，维生素B 9和维生素B 12 ; 维生素B 3酰胺和维生素B 5 0.05至5μM类似地，将各个内标储备溶液混合以制备内标混合溶液。为了量化牛奶样品中的水溶性维生素，通过将20μL同位素标记的内标混合物添加到Eppendorf管中的100μL校准溶液中来生成7点校准曲线。还通过将同位素标记的内标混合物添加到100μL牛奶中来制备乳样品。

（6）使用ICP-MS进行痕量元素分析

ICP-MS是一种用于测量生物样品中金属离子和其他微量元素的强大而灵敏的方法。对于该研究，在商业牛奶样品上进行的所有痕量元素分析在PerkinElmer Sciex Elan 6000四极杆ICP-MS（Woodbridge，Canada）上进行，使用先前描述的方法以双检测器模式操作。

（7）文献中的牛奶代谢物

通过使用最初为人类代谢组计划（HMP）和人类代谢组数据库（HMDB）开发的几个内部文本挖掘软件包对已知的牛奶代谢物及其浓度进行了广泛的文献综述。（两个最有用的程序是PolySearch 和PolySearch2。（这些程序能够将简单的关键字（即“牛奶”，“牛”等）作为输入，并快速创建PubMed（和其他数据源）的摘要和论文的超链接列表，其中包含有关牛奶代谢物及其相应的信息浓度数据。PolySearch2能够通过使用诸如“牛奶”，“牛奶”，“乳制品”，“牛”和“牛”之类的术语以及诸如“浓度”之类的词语来测量单词共现频率来编制排名的牛奶代谢物列表。“，”鉴定“，”定量“，”mM“或”micromol“。PolySearch2还从摘要中提取关键句子，然后对文本中提到的代谢物进行标记和超链接。这导致鉴定了约150篇关于牛奶的相关化学信息的论文，摘要和教科书。

对所有文献衍生的化合物及其浓度和参考文献进行编译，比较，并将它们的名称“标准化”以匹配HMDB，CAS和PubChem标识符。手动导出的化合物数据使用名为DataWrangler的内部程序进一步注释，它自动生成名称，同义词，描述，结构，化学分类，物理属性数据和生物利用度。DataWrangler生成的信息由三位不同的科学家手动检查，他们拥有生物化学，生理学和/或动物科学的研究生学位。手动检查完成后，数据随后输入牛奶成分数据库（MCDB）。手动交叉检查浓度以识别输入值之间的大差异（> 3×）。重新分析超过此阈值的那些以查看是否已进行数据输入错误。对于高度差异的值，使用“多数赢”方案来选择最佳或最可能的值。另一方面，如果我们的实验数据与其中一个差异值最匹配，然后选择该值而不是其他报告的值。由此产生的1030份文献衍生的牛奶代谢物（包括122种重叠的实验衍生代谢物）及其浓度数据（如果有的话），有助于证实我们的实验分析中发现的许多代谢物和代谢物浓度。

研究结论

（1）综合文献综述和实验工作促使972种代谢物或代谢物种的鉴定和/或定量，对应于牛乳中2355种独特的代谢物结构。确定的绝大多数化合物是甘油三酯（1053）。使用该实验方法，首次在牛奶中鉴定或报告了许多化合物。这些包括LysoPC（18：2）（0.16-0.19μM），PC（28：1）（0.54-0.89μM）和TG（48：3）（1.6-573μM）。除了通常在牛奶中发现的预期内源性化合物外，我们的文献综述显示存在大量植物化学物质，如水杨酸盐，牛尿酚，大豆苷元，芒柄花素和染料木黄酮（23,48-50）以及许多污染物或滴滴涕，六氯环己烷和硫丹等农药残留。

（2）对四种商品牛奶进行了全面的文献综述以及全面的定量代谢组学研究。代谢组学研究使用各种分析技术的组合，包括NMR，LC-HRMS，LC-MS / MS和ICP-MS，而文献综述则通过计算机辅助文献挖掘来促进。共报告了168种化合物或化合物（相当于1285种独特结构），包括2种LysoPCs，7种Cers，15种DGs，16种SMs，35种TGs，62种PC和31种其他化合物，所有这些化合物都是已被添加到MCDB。正如可以预料的那样，本研究清楚地表明，与低脂肪（2％，1％和脱脂）品种相比，高脂肪（3.25％）牛奶中脂质化合物的浓度要高得多，而非脂质化合物的浓度在不同的牛奶品种中没有显着差异。实验获得数据相当于MCDB中报告的牛奶代谢物/化学品总数的61％。该汇编代表了迄今为止已完成的最完整的牛奶化学品库存或化学评估。所有这些信息以及有关浓度范围，化学结构，名称，化学类别，NMR和MS谱，其他物理化学性质和相关参考的其他详细信息均可在MCDB中公开获取。该汇编代表了迄今为止已完成的最完整的牛奶化学品库存或化学评估。所有这些信息以及有关浓度范围，化学结构，名称，化学类别，NMR和MS谱，其他物理化学性质和相关参考的其他详细信息均可在MCDB中公开获取。该汇编代表了迄今为止已完成的最完整的牛奶化学品库存或化学评估。所有这些信息以及有关浓度范围，化学结构，名称，化学类别，NMR和MS谱，其他物理化学性质和相关参考的其他详细信息均可在MCDB中公开获取。

（3）在未来几年，研究团队计划使用其他代谢组学技术进一步表征牛奶代谢组，即GC-MS，GC×GC-MS（以帮助鉴定挥发性化合物），非靶向FT-MS和更广泛的靶向LC-MS / MS技术比较和扩展代谢物的覆盖范围。与实验室提供的先前代谢组学研究相似，本研究的主要目标之一是通过展示这些技术的能力和潜力来全面表征常见的生物流体，从而推动定量代谢组学领域的发展。这里提出的结果也远远超出了现场代谢组学，特别是考虑到牛奶在食品工业中的经济重要性及其在人类和动物营养中的重要性。希望这些数据可作为比较各种技术和评估牛奶研究未来方法改进的基准。与此同时，希望MCDB通过提供全面，易用且高度集中的基于Web的资源，为代谢组学研究人员，动物科学家，食品化学家，营养科学家，医生和消费者提供可靠的来源。关于商业牛奶的化学成分。

延伸阅读

本文的工作量较大，涉及到了乳，乳制品，核磁共振，质谱，液相，代谢组学等知识。以下链接是相关英文书单，对于理解本文具有较好的帮助。