蛋白质的定量定性检测知多少

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蛋白质定性分析 ：确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在的是何种蛋白质。

蛋白质定量分析 ：确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白成分的含量。

1 颜色反应

蛋白质分子中某种（某些）基团能与部分显色剂作用，产生特定的颜色反应，可以对蛋白质进行定性检测。不同蛋白质因含不同的氨基酸，颜色反应便不同。

常用的蛋白质或氨基酸的颜色反应↑

另外，通过燃烧能否产生烧焦羽毛的气味也能检验蛋白质的存在。

2.定量检测

（1）凯氏定氮法：生物体内的含氮物质以蛋白质为主，而各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16%，因此只要测定生物样品中的含氮量，就可以推算出蛋白质的大致含量。计算公式：蛋白质的含量=每克样品含氮×6.25。

（2）紫外检测法（紫外光谱吸收法）：色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm附近，而大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值可以快速简便地分析溶液中蛋白质的含量。

芳香族氨基酸的紫外吸收↑

所需时间：几分钟

优点：①速度快②对蛋白质无破坏性。

缺点：①不是严格的定量，适用于测定蛋白质粗提液②核酸可引起强干扰作用。

灵敏度：0.2 mg/ml～2 mg/ml

计算方法：①标准曲线法②蛋白质浓度 (mg/ml)=1.45×A280-0.74×A260

（3）考马斯亮蓝染色法：考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。蓝色复合物在595nm波长处具有最大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度成正比，因此可检测595nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量。

所需时间：10分钟

优点：①快速（反应时间仅需2 min）②敏感，几乎没有蛋白质损失。

缺点：①对各种纯化蛋白质反应不同②用这种测定方法对蛋白质引起不 可逆的变性。

灵敏度：25 ug/ml～200 ug/ml

计算方法：标准曲线法

（4）Lowry检测法：酪氨酸和色氨酸能与Folin—酚试剂发生氧化还原反应，生成深蓝色复合物，其在745—750nm处有最大吸收峰，颜色的深浅（吸收值）与蛋白质浓度成正比，可根据750nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量。这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已得到广泛应用，在检测之前可通过蛋白质沉淀将干扰物质去除

所需时间：40分钟

优点：①一种可靠的蛋白质定量方法②不同蛋白质之间差别很小。

缺点：①干扰物质多②反应速度慢。③某些试剂不稳定④使蛋白质发生不可逆变性。

灵敏度：5 ug/ml～100 ug/ml

计算方法：标准曲线法

（5）BCA（二喹啉甲酸）检测法：在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与Cu2+还原成Cu+。而BCA试剂可敏感特异地与Cu+结合，形成稳定的紫色复合物，在562nm处有最大光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据的光吸收值大小计算蛋白质的含量。这是近年来新研制的一种改进的Lowry测定法，反应简单而且几乎没有干扰物质的影响。

优点：①单一试剂②终产物稳定。③与Lowry法相比几乎没有干扰物质的影响。

缺点：①反应时间长②使蛋白质发生不可逆变性。

灵敏度：①标准检测： 10 ～ 1200 ug/ml；②微量检测： 0.5 ～10 ug/ml

计算方法：标准曲线法

（6）甲醛滴定法：用甲醛处理氨基酸的水溶液，可使氨基中的氢离子被释放出来，再用碱滴定氢离子，从而测定氨基酸的含量。

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