厦门大学黄维院士、李林教授课题组：基于新型荧光抑制剂探针的胶质瘤MAO-A组学分析与超分辨成像

单胺氧化酶A（MAO-A）在胶质瘤和其他神经疾病的发展中发挥着至关重要的作用。厦门大学柔性电子（未来技术）研究院黄维院士、李林教授团队报道了一种基于MAO-A酶促活化的荧光抑制剂探针（HD1），通过对人脑胶质瘤细胞和组织中内源性MAO-A的高灵敏、高选择性共价标记与荧光“点亮”，实现原位超分辨成像和蛋白质组学分析，为临床样品MAO-A检测和靶向治疗研究提供了实用性新工具。

单胺氧化酶（Monoamine Oxidases，MAOs）是表达于线粒体外膜上的一类功能型蛋白酶，氧化代谢生物体内单胺类物质，主要包括神经递质和外源性的氨类化合物。MAOs的功能异常与神经胶质瘤（Glioma）、帕金森病（Parkinson’s Disease，PD）等中枢神经系统（Central Nervous System，CNS）疾病关系密切。基于各自代谢底物的不同，MAOs分为两种亚型（MAO-A和MAO-B），两者的氨基酸序列相似率高达70%以上，使用荧光探针对两者进行区分检测与分析是一项具有挑战以及生物学意义的工作。黄维院士和李林教授带领的有机/生物医学光子学课题组（Organic Biomedical Photonics，OBP）一直关注MAOs不同亚型的功能差异与CNS疾病之间的联系，先后开发了多个用于MAO-A和MAO-B分析检测的高特异性荧光探针。

近年来，越来越多的研究揭示MAO-A在胶质瘤的发生与发展中扮演者重要角色，有望成为胶质瘤的治疗靶点。为了实现对胶质瘤临床样本中MAO-A活性及其药物相互作用的特定分析，该团队开发了基于MAO-A活性的组学分析与超分辨成像的荧光抑制剂探针的HD1，探针结合了团队先前报道的MAO-A双光子荧光探针F1和MAO-A特异性抑制剂Clorgyline（CL）的关键结构特点。HD1具有一个新设计的反应基团，N-丙炔基四氢吡啶，当丙烯基氨基团发生酶促活化时，探针能够与MAO-A形成共价缀合物，并经过四氢吡啶到吡啶盐转换从而增大分子共轭体系以增强荧光。为了使HD1同时适用于蛋白质组学分析，其二甲胺基团上添加了一个末端炔基用于进行生物正交反应。

图1. 探针HD1的设计与工作策略

随后，作者对HD1进行了基于荧光性质测试，酶促动力学分析和荧光凝胶分析的验证。结果显示HD1保持了对于MAO-A的优异选择性，其MAO-A的半数标记速率（K_i）仅为0.285 μM。此外，HD1还可作为MAO-A潜在抑制剂的筛选工具，其结果与商业试剂盒（Amplex Red MAO Assay Kit）具有高度一致性。作者同时将HD1与先前报道的MAOs探针进行了肩并肩的荧光凝胶分析，结果显示在完全相同的条件下，HD1只特异性的标记MAO-A，几乎检测不到对于MAO-B的荧光标记。

基于以上的结果，作者进一步将HD1用于包括经CRISPR-Cas9调控MAO-A表达的多种哺乳动物活细胞（如恶性星形胶质瘤细胞U87，神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y等）中内源性MAO-A的选择性标记，结果显示HD1在所测试的细胞系中都表现出了对于MAO-A表达量依赖性的特异性荧光标记。作者同时使用了蛋白质质谱对所标记的蛋白进行了鉴定，确认了所标记的蛋白为内源性MAO-A，同时细胞热位移分析（CETSA）也显示经过HD1处理的U87细胞中MAO-A的熔化温度提高了4.2^oC。

最终，作者成功将HD1用于临床胶质瘤和瘤旁组织样本中MAO-A的标记与活性检测。荧光凝胶标记和孔板荧光分析准确提示了两种组织中MAO-A的表达量与活性差异。同时，HD1对于MAO-A稳定的原位标记成功地实现了U87和SH-SY5Y细胞中MAO-A的精准定位，通过结构光照明显微镜（SIM）可以清晰观察到荧光信号位于线粒体外膜上。

图2. HD1对于临床胶质瘤样本中内源性MAO-A标记与或细胞中MAO-A的超分辨荧光成像

相关成果近期在线发表于Science China Chemistry。厦门大学柔性电子（未来技术）研究院博士后方海啸和西北工业大学博士研究生李盼盼为文章的共同第一作者，厦门大学柔性电子（未来技术）研究院潘思骏副教授、李林教授和黄维院士为共同通讯作者。详细内容见：Haixiao Fang, Panpan Li, Congzhen Shen, Fang Tang, Aixiang Ding, Hua Bai, Bo Peng, Xuekang Yang, Zhengqiu Li, Kai Huang, Sijun Pan, Lin Li, Wei Huang. Sci. China Chem., 2023, doi: 10.1007/s11426-023-1602-7.

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