RNase R使用攻略

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声 明

Ribonuclease R (RNase R)是一种核糖核酸外切酶，广泛应用于circRNA的鉴定、富集和相关实验。笔者注意到很多研究人员在使用中碰到了一些问题和“奇怪”的现象，下面就来简单的梳理一下，并在参考文章和资料的基础上给出解释和建议。

1 RNase R的功能

RNase R来源于大肠杆菌RNR超家族，可以从3’-5’方向切割降解RNA，能够消化几乎所有的线性RNA分子，但不易消化呈环形的RNA、套索结构或3’端突出末端少于7 nt的双链RNA分子（Cheng ZF et al., 2002）。

图1 RNase R消化RNA示意图（吉赛生物）

2 RNase R的反应体系

关于RNase R的具体使用量和反应体系，不同参考文章里也有差别，常见的为10 μL或20 μL反应体系，使用比例为3U RNase R/μg RNA，下图是一个推荐的反应体系。

图2 RNase R消化反应体系（吉赛生物）

3 什么时候用？

RNase R主要用于circRNA的鉴定和富集实验，需要根据具体的实验内容和目的来决定是否进行RNase R消化。

3.1 circRNA的鉴定

circRNA的鉴定常使用RT-PCR（图3, 4）和Northern blot实验（图5，6），根据RNase R(+)和RNase R(-)组中是否检测到条带来证明检测的分子是circRNA。

图3 使用RT-PCR检测mRNA，在RNase R(-)中有条带，在RNase R(+)中无条带；检测Lariat/Circular RNA，在RNase R(-)和RNase R(+)样品中都有条带，表明mRNA被消化，而Lariat/Circular RNA耐受消化（Suzuki H et al., 2006）

图4 RNase R消化后分别以Divergent Primer和Convergent Primer检测cDNA样品。RNase R(+)中Divergent Primer有条带，Convergent Primer无条带；RNase R(-)中Divergent Primer和Convergent Primer都有条带，表明检测的基因为circRNA，并且耐受RNase R消化（Yibing Y et al., 2018）

RT-PCR中若要证明检测的基因是否为circRNA，需要体现在RNase R(+)和RNase R(-)组中条带有无和丰度高低有差异，这种情况是需要做RNase R消化的，也可以和分别使用Divergent Primer和Convergent Primer检测cDNA和gDNA样品的结果结合起来。如果是以qPCR进行定量检测，一般可以不做RNase R检测，即不需要对circRNA进行富集（线性RNA被消化），因为Divergent Primer和Convergent Primer基本可以保证检测的特异性。

图5 以3U RNase R/µg RNA 进行RNase R消化15分钟，电泳显示RNase R(+)组中28S/18S条带变淡。使用同时检测circRNA和mRNA的探针进行Northern blot实验，结果显示RNase R(+)组检测不到线性的Gapdh、Phf21a、Elf2、Mfsd6、Stau2或Zfp609，可以检测到对应的circRNA，表明mRNA被消化，而circRNA耐受消化（Rybak-Wolf, A. et al., 2015）

图6 RNase R消化产物电泳显示RNase R(+)组中28S/18S/5S条带变淡。Northern blot检测显示RNase R(+)组中无线性GAPDH的条带，CDR1as和hsa-circRNA 2/3/16能检测到条带，表明线性RNA被消化，而circRNA耐受消化（Memczak S et al., 2013）

Northern blot实验使用探针特异性检测内源的circRNA和线性RNA，过程中无PCR扩增，能够真实地反映circRNA和线性RNA的定性定量分析结果，是circRNA鉴定中必不可少的一个实验。

3.2 circRNA的富集

高通量测序时常需要对circRNA进行富集，此时RNase R消化就是必须的。为探究RNase R消化后circRNA的富集程度和相关基因的变化，可以同时做RNase R(+)和RNase R(-)组样品的测序。笔者实验室的测序显示RNase R(+)组中junction reads相对于RNase R(-)样本有5-10倍的富集，可鉴定出几千到上万个circRNAs。

图7 RNase R(+)和RNase R(-) RNA测序示意图（Jeck WR et al., 2014）

4 RNase R消化的效果

Total RNA经消化后直接进行电泳检测，RNase R(-)组中28S/18S/5S三条带单一明亮，而RNase R(+)组中28S/18S/5S条带会变淡或不可见（Rybak-Wolf, A. et al., 2015; Suzuki H et al., 2006）。但如果RNase R+组中5S条带加亮，且28S/18S条带处有拖尾，则可能是RNA被外源RNA酶降解，而不是RNase R消化产生的，如不能确定降解是发生在电泳过程中还是RNase R消化反应中，可以尝试在RNase R消化反应体系中加入RNase inhibitor。

a图

b图

图8 a, RNase R消化后条带变淡；b, RNase R消化后条带不可见（Rybak-Wolf, A. et al., 2015; Suzuki H et al., 2006）

5 实验细节和常见问题

5.1 测量浓度

实验中要先对total RNA测量浓度，以计算相应的比例和使用量来进行RNase R消化。消化后的产物无需测量浓度，实际上因为反应体系内的蛋白质、盐离子等成分影响，测量到的浓度也不会准确。

5.2 纯化回收

经RNase R消化后的RNA可使用苯酚：氯仿：异戊醇（25: 24:1, V: V）溶液抽提，再使用乙醇沉淀回收；或者使用RNA纯化柱和磁珠进行纯化回收。经RNase R消化后直接进行RT-PCR的，一般可以不做纯化，酶失活后直接进行逆转录反应即可（Legnini I et al., 2017; Guarnerio J et al., 2016）。

注：苯酚：氯仿：异戊醇（25: 24:1, V: V）溶液最好现配现用，没有试剂也可以Trizol Reagent代替。

5.3 RNase R消化反应温度和时间

RNase R消化一般于37℃进行反应，时间10-30 min为宜（Memczak S et al., 2013; Legnini I et al., 2017），不推荐过长时间的消化。另外检测不同的基因可能也需要摸索反应时间，笔者实验室直接用于RT-PCR检测时常用5-15 min消化就能得到很好的结果，线性基因丰度可以降低几十到几百倍，circRNA丰度则基本不变。

经RNase R消化后直接进行逆转录反应的，推荐在37℃反应结束后保持70℃ 10 min使RNase R灭活（Cheng ZF et al., 2002）。如果消化后要进行纯化回收，也可以不做酶的失活。

5.4 qPCR定量计算

RNase R消化后不能再使用ACTB或GAPDH作为内参，此时可以将原始的RNA等分为两份，一份进行RNase R处理（RNase R(+)），另一份不处理（RNase R(-)），统一以RNase R(-)组中的内参为计算标准（Zhang Y et al., 2016）。

另外在RNase R消化后如果进行纯化回收，RNA的浓度可能会有变化，不适宜再以RNase R(-)组中的内参为计算标准。此时可以在纯化回收前加入少量其他物种的RNA作为外参，统一以外参标准化样品后进行计算（Rybak-Wolf, A. et al., 2015; Pamudurti NR et al., 2017）。

5.5 circRNA也被消化？

实验中有时会发现经RNase R消化后部分circRNA丰度也有明显降低，此时要检查消化反应体系有无问题，考虑是否被外源RNA酶降解。另外有些circRNA在经长时间RNase R消化也会丰度降低，可能是因为其耐受RNase R消化力弱（Zhang Y et al., 2016）。

图9 RNase R消化0-120 min，检测circCAMSAP1在15 min时就被明显消化（Zhang Y et al., 2016）

图10 RNase R消化后进行qPCR检测，RNase R组中has-circRNA 2/3/6/9/16和CDR1as丰度有轻微降低，但和GAPDH相比，circRNAs显示有不低于10倍的耐受RNase R消化力（Memczak S et al., 2013）

笔者实验室也经常会检测到RNase R消化后circRNA丰度会降低的情况，一般缩短消化时间可以减少circRNA被消化的可能，另外对比线性RNA和circRNA消化后丰度降低的倍数，是明显能看到circRNA比线性RNA耐受消化的。

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