为了毕业，我竟然做错这么多！
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声 明
大家好，我叫大强，这是我临毕业前的忏悔书，请一定要读到最后
我的老板三年前回国，手上还有一部分数据，我有幸成为他的第一位学生，延续这些数据做了些PCR和过表达，
事情要从两年前说起，新课题做完circRNA的测序和部分验证，鉴于我前期的优（te）秀（bie）表（xing）现（yun），老板选了前50个circRNAs交给我做过表达，扔下一句话：
没吃过猪肉还没见过猪跑吗？构建50个载体而已，麻溜儿地就跑回实验室准备大干一场。不过毛主席教导我们要在战略上藐视敌人，战术上重视敌人，做实验前先看文献大概是我唯一坚持下来的好习惯了。
这一看才发现没那么简单，原来和mRNA的过表达完全不一样啊，什么CMV/SA/SD/PA完全不知道什么原理啊！不过没关系，反正也是RNA嘛，从DNA转录而来，那应该直接连进质粒就行了。手头正好有老板给的pcDNA3.1(+)，设计了两个构建就开始做了。
果然实践出真知呀，现在想来那么简单的载体构建连接实验，竟然整整折腾了一个月才成功
然后迫不及待的去隔壁实验室做了瞬时转染、提RNA、逆转录、qPCR，一顿操作猛如虎，
我这一脸懵逼去跟老板汇报，老板也不生气，考考我载体构建实验操作过关了，质粒过表达原理也基本了解，还知道要用circRNA的成熟序列连进载体。是个好的开头呀，不过circRNA的过表达除了要能转录出来RNA链，还要能剪切成环才行，可不是想当然就行的，回去再琢磨琢磨吧，
好吧，这是我的第一个错误，想当然！
很快地看文章发现circRNA在体内的成环是依靠侧翼序列的，有几篇文章就是在载体上同时克隆了侧翼包含SA/SD的序列，但是侧翼序列取多长却没说清楚呀。
得，那做个对照实验，分别取500和1000bp吧，也是挑了两个circRNAs来构建。但是序列设计出来了，这PCR没办法做呀，上游侧翼序列/circRNA序列/下游侧翼序列是分开的呀，用cDNA或gDNA为模板都没办法直接P出来，索性直接做基因合成吧。
舒舒服服地等了三周终于拿到构建好的质粒，同样迫不及待的去隔壁实验室做了瞬时转染、提RNA、逆转录、qPCR，一顿操作猛如虎，成功了，
赶紧跑去跟老板汇报，老板对结果倒是很满意，但是为什么一脸严肃呢？一转身劈头盖脸扔过来一堆问题：你这过表达做个PCR就算结束啦？过表达成功与否只用Divergent引物检测吗？PCR产物有测序吗？能证明成环序列是准确的吗？这样的检测严谨吗？去再看看别人是怎么做的，
好吧，这是我的第二个错误，实验检测不严谨！
但是文章里确实只讲到了用Divergent引物检测啊，得，去泡泡丁香园论坛啊微信公众号什么的吧，这一看还真找到不少好东西
circRNA因为特殊的首尾成环模式，检测过表达时需要对PCR产物进行电泳看是否单一条带和大小是否正确，另外要用两对引物同时做检测，之前的Divergent引物只适合做PCR产物的测序，还有一种叫Sjod (Splice Junction Overlapping Divergent )的引物，是用来特异检测circRNA过表达倍数的。
于是抓紧设计Sjod引物后重新做了PCR检测，结果很理想，都是准确成环的，不过用500bp侧翼序列构建的载体只有过表达几十倍，而用1000bp侧翼序列构建载体的两个circRNAs都有近千倍的过表达。
于是汇总下结果去汇报，老板：这两个过表达还不错，使用侧翼1000bp构建载体这样的方法是可行的，但是我们要同时做50个circRNAs的，都这样拿去合成基因你算过价格吗？难道侧翼序列不能移植到其他circRNA，每个都要单独用本身的侧翼序列来构建？回去试试设计通用的侧翼序列载体，50个基因用同样的侧翼序列不就方便了嘛，另外看看Overlapping PCR方法，不要再傻傻地跑去合成基因了，
后来才发现用Overlapping PCR或者In-fusion克隆都能很方便的把上游侧翼序列/circRNA序列/下游侧翼序列三段同时连到载体上，合成基因纯粹就是浪费钱啊。
是的，这是我第三个错误，没有考虑实验成本，还有傻，哦不，还有没考虑到侧翼序列载体的通用性！
这次我重点看了circRNA形成机制和成环规律的文章，原来侧翼序列成环是依赖Alu元件或内含子互补配对的，并且有文章探究侧翼序列中Alu元件是可以直接控制成环的，载体上只用Alu元件构建序列也可以成环。
我找了几个基因的侧翼序列，发现正好有一对反向的Alu元件，于是设计了一个300bp Alu1 + circRNA + 300bp Alu2整段构建载体的序列，先拿去给老板看看，老板：设计思路基本上可以，但是成环时剪切是怎么实现的呢，能不能控制准确成环？顺着这个思路，我又增加了一段spacer序列，整体就是300bp Alu1 + 50bp spacer + AG + circRNA + GT + 50bp spacer + 300bp Alu2，spacer里放了几个酶切位点，这样再连接其他的circRNAs序列就方便多了。
这次方案是老板首肯的，所以我一口气构建了10个circRNA的载体，用同样的成环序列还真是省了不少事
接着同样的细胞瞬时转染、提RNA、qPCR检测，工作量大了确实累人呀，可是结果让我更加心累。10个circRNAs中有9个成功过表达了，但是PCR产物测序发现只有3个是准确成环的，其他6个都出现了成环错误，都是将侧翼的成环序列一部分加到circRNA序列内了，很明显是在错误的AG和GT位置剪切了。
再去跟老板汇报，还是很淡定的回复：看来这个成环剪切不好控制呀，换个spacer序列试试，另外酶切位点不要放这么多，而且上下游长度要一致，改改这样再试试吧，还是要多看文献多学习
好吧，我有错吗？就怪我错误预估了实验难度吧！
这一次再做就有些忐忑了，换了一段不同的spacer序列重新设计载体序列，整体就是300bp Alu1 + 40bp spacer + AG + circRNA + GT + 40bp spacer + 300bp Alu2，很快就构建好载体，等qPCR结果时这个煎熬呀，真想有个杨超越附体，保佑我顺利成功。
可惜那一年我还没有信仰杨超越，结果也确实不咋地，同样是9个成功过表达，但只有4个准确成环，另外5个都是成环错误了。这次给老板汇报，他还是很淡定：看来确实不好办，成环倒是简单，控制准确剪切确实不容易实现。这样吧，我看到吉赛生物有商业化的circRNA过表达载体，我安排你去那里学习学习，看看用他们的载体效果怎么样，还是要记得多看文献多学习
后来在吉赛生物，我看到了一个通用的circRNAs表达载体的超高难度和研发过程的曲折，他们团队前后测试过二十几个成环序列才确定一个成熟的circRNA表达框架，很巧妙的预留酶切位点时增加了环化介导序列，仅仅18bp的介导序列就能保证插入的circRNAs序列准确高效率成环过表达，并且很快获得了国家发明专利授权。听说最近又升级到了第五代载体并大力推广，成功率更高，价格更优。
在这时，我才切身体会到自己最大的错误：缺乏与其他人的交流和互相学习，一门心思闭门造车实在不可取啊！
吉赛生物给我印象最深的还有他们研发团队的专业严谨和高效的团队协作，从构建载体到qPCR验证最快只需要两周时间，这个时间我自己做的话载体可能才刚构建好。他们解决问题的高效和速度，解决办法的专业性和多样性，着实让我体会到了“专业的事让专业的人做”这句话的含义，也让我打开了思路，以后的实验都有不同的方向快速地解决问题。
为什么不早说
很幸运地，我们实验室又来了两个师弟，实验进度加快，照着miRNA sponge地套路做下来，我竟发了篇5分的文章，
回想起两年多的点点滴滴，要特别感谢我的导师，是他的耐心指导和适度放养让我完成了从“学渣”到“学霸”的逆袭，感谢两位师弟的大力帮助，也感谢吉赛生物提供的技术支持，我会永远记住导师的教诲--多看文献多学习。
好了，我是大强，以上就是我两年多来的错误和教训，希望可以成为大家的经验。
我是大强，这条新消息请务必点击查收。
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