Molecular Cancer: 环状RNA AKT3翻译新功能蛋白负调控PI3K/AKT信号通路抑制脑胶质瘤

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8月30日，国际知名肿瘤学期刊Molecular Cancer（IF: 10.679）在线发表了中山大学附属第一医院张弩教授团队的最新报道“A novel tumor suppressor protein encoded by circular AKT3 RNA inhibits glioblastoma tumorigenicity by competing with active phosphoinositide-dependent Kinase-1”，证明环状RNA AKT3利用重叠密码子翻译新的功能性蛋AKT3-174aa，体内外研究显示AKT3-174aa蛋白通过与经典PI3K/AKT信号通路关键调控激酶PDK1互作负调控PI3K/AKT信号通路，抑制脑肿瘤的发生发展。环状RNA利用重叠密码子翻译蛋白是环状RNA翻译的一种独特模式，对于circRNA新的功能研究有重要参考意义。

环状RNA circ-AKT3筛选识别鉴定

研究者首先通过对脑胶质瘤标本进行深度测序挖掘差异的circRNA分子，从中锁定候选分子 circ-AKT3（circbase登录号：hsa_circ_0017250）。本文研究的circ-AKT3是由AKT3基因的第3到第7共5个外显子环化形成，长度524nt，通过sanger DNA测序验证其环状RNA的准确接口，Northern Blot鉴定circ-AKT3 RNA细胞内源性客观存在，QPCR在脑胶质瘤组织以及细胞系检测，结果显示circ-AKT3在肿瘤样品中表达降低且环状RNAAKT3 耐受核酸外切酶RNase R切割，半衰期相比线性 AKT3母基因也较长；胞核胞浆分离以及FISH荧光原位杂交检测证明circ-AKT3 RNA分子定位于细胞质。

图1 circRNA筛选分析与circ-AKT3识别鉴定 （来自[1]）

证明circ-AKT3能利用重叠密码子翻译蛋白

作者对circ-AKT3进行了ORF和IRES分析，表明circ-AKT3有翻译蛋白的潜能，预测的ORF编码174个氨基酸的新蛋白，将该蛋白命名为AKT3-174aa。circ-AKT3在circRNADb环状RNA翻译数据库中也有收录http://202.195.183.4:8000/circrnadb/detail_info.php?circ_id=hsa_circ_25440，circRNADb数据库预测了circ-AKT3翻译蛋白质的潜能以及可能的IRES元件。有意思的是，circ-AKT3所对应的ORF是跨环状RNA接口后形成终止密码子的，终止密码子和起始密码子发生了重叠，这样的翻译模式是环状RNA独有的（只有环状RNA形成后才能形成），具体如下图所示：

图2 circ-AKT3翻译AKT3-174aa（来自[1]）

为了验证circ-AKT3翻译过程在细胞中客观存在，作者通过双荧光素酶报告系统验证了circ-AKT3存在的IRES具有驱动翻译的活性以及检索了商业化的抗体库，检索到了能够识别鉴定AKT3-174aa的商业化抗体，在多种细胞系以及临床组织标本中检测到了circ-AKT3翻译的蛋白产物AKT3-174aa客观存在；进一步研究者通过蛋白质谱鉴定到了环状RNAcirc-AKT3翻译的独特氨基酸序列。AKT3-174aa蛋白无论是细胞系还是临床组织中都显示在肿瘤里面低表达并且和生存期有关联，结果暗示AKT3-174aa可能扮演抑癌基因的作用。

AKT3-174aa细胞生物学功能研究

研究环状RNA circ-AKT3翻译的蛋白AKT3-174aa具有功能，研究者通过在脑胶质瘤过表达以及干扰表达实验，检测细胞的增殖（MTT、Edu、平板克隆、软琼脂克隆） 和放射诱导的细胞凋亡；细胞生物学功能结果提示，过表达环状RNA circ-AKT3以及AKT3-174aa能抑制肿瘤细胞的增殖及克隆形成，放射诱导的细胞凋亡增加，shRNA干扰后，相反的现象，而突变IRES序列，使得circ-AKT3翻译蛋白的潜能丧失，结果显示circ-AKT3-IRES-mut对细胞的作用不明显，提示circ-AKT3的功能主要是通过翻译蛋白AKT3-174aa起作用。

图3 circ-AKT3翻译AKT3-174aa细胞生物学功能研究（来自[1]）

图4 AKT3-174aa蛋白具有生物学功能而不是环状RNA本身（来自[1]）

AKT3-174aa作用分子机制研究

 AKT3作为PI3K/AKT信号转导通路的关键枢纽分子，在肿瘤中的研究报道较多，研究者通过表达谱测序发现，过表达circ-AKT3后，PI3K/AKT通路也显著发生了变化；细胞系检测结果提示，过表达circ-AKT3后，总AKT蛋白没有发生明显变化，AKT的308苏氨酸位点的磷酸化发生明显减低，而AKT 的473丝氨酸位点的磷酸化也没有明显变化；干扰circ-AKT3是相反的结果；结果提示circ-AKT3可能是通过影响AKT的308位点苏氨酸的磷酸化发挥作用。研究者通过IP结合蛋白质谱鉴定以及GST pull down实验，结果提示circ-AKT3翻译的AKT3-174aa蛋白可以直接结合PDK1；激光共聚焦也显示AKT3-174aa和PDK1（磷酸化形式）有共同的亚细胞定位。

图5 AKT3-174aa通过结合PDK1抑制AKT家族308位点磷酸化（来自[1]）

AKT家族（AKT1,2,3），其中发生磷酸化的主要是AKT2和AKT3；并且其磷酸化是被特定的激酶催化，308位点磷酸化的公认催化激酶是PDK1；研究者在过表达circ-AKT3后发现PDK1激酶的活性得到抑制；shRNA干扰后得到相反的结果，通过进一步研究circ-AKT3的作用，作者通过IP实验证实AKT3-174aa通过结合p-PDK1主要影响AKT2/3分子的磷酸化发挥负调控PI3K/AKT信号通路。

图6 AKT3-174aa通过结合p-PDK1影响AKT2/3分子的磷酸化（来自[1]）

最后，作者通过原位移植脑胶质瘤细胞到小鼠的脑部，构建原位脑肿瘤形成模型。在动物模型体内实验中过表达AKT3-174aa对胶质瘤成瘤有明显的抑制作用；在两株小鼠内不成瘤（低恶性脑瘤细胞）的脑胶质瘤细胞系中，shRNA干扰掉circ-AKT3后，促进了肿瘤的形成。动物实验结果显示，AKT3-174aa是一个具体抑癌功能的蛋白。

图7 AKT3-174aa蛋白抑制小鼠移植脑胶质瘤成瘤（来自[1]）

本研究证实circRNA可以翻译功能性蛋白， circRNA分子通过利用重叠密码子翻译是环状RNA翻译蛋白的一种独特模式。环状RNA 利用重叠密码子翻译的现象偶尔会见到在病毒的基因组中 (AbouHaidar et al., 2014 PNAS)，2017年本文的研究者也首次证明在人类的细胞中环状RNA circ-SHPRH能利用重叠密码子编码功能蛋白(Maolei Zhang et al., 2017 Oncogene)，  环状RNA circ-AKT3是本团队发现的第二个人类的环状RNA利用重叠密码子翻译蛋白的分子。研究者发现了环状RNA的一种独特的蛋白翻译模式——环状RNA可以利用重叠密码子翻译蛋白，这种独特的蛋白翻译模式可能是一种高度“经济化”和精密的翻译蛋白的方式，期待广大科研工作者深入的研究。

原文出处链接：

1https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-019-1056-5

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