circRNA的m6A修饰再发一篇Nature Communications文章

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10月16日， Nature Communications杂志在线发表了一项circRNA m6A修饰的文章，报道发现m6A修饰的circNSUN2可结合YTHDC1并促进出核，进一步结合IGF2BP2促进HMGA2 mRNA的稳定，最终促进大肠癌的肝转移增强[1]。文章的通讯作者是中山大学附属肿瘤医院的谢丹教授，徐瑞华教授和Wang Fengwei。

以m6A为代表的RNA修饰是近几年的热点研究方向，circRNA目前已有多篇文章报道可携带m6A的修饰。推荐阅读：

本文的机制表明m6A修饰可调控circRNA的出核，是circRNA修饰研究的重要进展。下面就让我们一起学习一下这篇文章：

如何找到circNSUN2分子的？

作者通过芯片法分析了两对大肠癌（CRC）与癌旁的circRNA表达谱，共找到13167种circRNA分子。基因拷贝数异常（CNV）的区域经常是肿瘤驱动基因的位置，作者提出是否该区域的circRNA与肿瘤发生发展有关？于是作者选择了CRC最常见的CNV 位点（拷贝数增加的位点：5p15.31，8q24.21，8q24.3，13q12.13：拷贝数降低的位点：5q21，18q21.1），芯片筛选得到的circRNA中比对到这些位点的circRNA有104种，其中与对应位点的增高或降低趋势一致的为38种，9种circRNA的变化趋势在两例肿瘤标本中是一致的。为进一步分析筛选有价值的分子，作者在97例CRC的标本库中分析了这9个circRNA的表达情况，其中4种circRNA在超过75%的标本中呈现出高表达的趋势。这其中circNSUN2在20例原发灶和对应肝转移的标本中表现为肝转移组表达的显著增高，并且伴随着肝转移程度的增加，circNSUN2的表达也呈现显著的增高趋势。在97例标本群体中，circNSUN2高表达的组生存状况显著低于低表达组。基于这些数据，本文选择circNSUN2作为研究的目标分子。

图1 circNSUN2在CRC中高表达，与肝转移相关 （[1]）

circNSUN2的鉴定

Sanger测序，反向引物设计，RNase R消化，Northern blot，放线菌素D处理后稳定性分析， FISH和亚细胞组分分析实验鉴定了circNSUN2的疾病情况。circNSUN2主要定位于胞质中。

图2 circNSUN2的鉴定 （[1]）

体内实验证明circNSUN2与CRC的肝转移相关

TC17细胞或PDX模型的细胞做shRNA稳定敲降或过表达circNSUN2，分析肝转移效率的影响情况。结果均表明干扰circNSUN2可以降低CRC的肝转移而过表达circNSUN2则促进肝转移。

图3  动物模型实验证明circNSUN2促进CRC的肝转移 （[1]）

circNSUN2与YTHDC1结合后促进出核

为探索circNSUN2的分子机制，作者通过RNA pull-down分析了相互作用的蛋白，差异条带质谱分析后发现了YTHDC1和IGF2BP2。pull-down产物Western检测，anti- YTHDC1的RIP实验均证明了circNSUN2与YTHDC1的相互作用。YTHDC1是已知的RNA m6A的Reader分子之一，上述结果证明了circNSUN2与YTHDC1的相互作用，是否意味着circNSUN2也可能携带了m6A修饰？meRIP实验证明了circNSUN2确实可以被m6A的抗体富集。序列分析预测到了circNSUN2中存在GAACU motif（已知的m6A修饰位点），设计突变实验，将其中的A突变为G，EMSA实验分析突变前后与YTHDC1的相互作用情况，结果表明突变后不再与YTHDC1相互作用。这就证明了circNSUN2的确存在m6A修饰，该修饰方式介道了与YTHDC1的相互作用。干扰YTHDC1后发现circNSUN2的亚细胞分布发生了变化，干扰后核内circNSUN2的丰度增高了。FISH定位分析也验证了这一现象。

图4  circNSUN2与YTHDC1结合后促进出核 （[1]）

circNSUN2与IGF2BP2结合

pull-down实验中还发现了circNSUN2可结合IGF2BP2，作者也对该蛋白进行了类似的分析，包括pull-down后Western分析，RIP实验。免疫荧光-FIH共定位分析也证明了circNSUN2与IGF2BP2的相互作用。IGF2BP2是一种RNA结合蛋白，与mRNA的稳定性有关，已知在CRC中与侵袭有关。作者首先个截短突变体实验分析了IGF2BP2结合circNSUN2的结构域位置，结果表明KH3-4 di-domain是特异性结合circNSUN2的结构域。之前已报道IGF2BP2结合RNA的motif是CAUH (H = A, U or C)，在circNSUN2中有该基序存在，于是基于位点突变前后EMSA分析，确定了circNSUN2与IGF2BP2结合。

图5 circNSUN2与IGF2BP2结合 （[1]）

circNSUN2/ YTHDC1/IGF2BP2复合体促进HMGA2 mRNA稳定

已知IGF2BP2与mRNA的稳定性有关，那么这里发现的circNSUN2与IGF2BP2的相互作用是否会影响一些mRNA的稳定性？为弄清楚这个问题，作者设计了干扰circNSUN2前后分析转录组的差异情况，结果有644种mRNA在干扰circNSUN2丰富发生显著变化。IGF2BP2通常结合mRNA 的3’UTR区富含AU的序列，基于这一规律，作者基于已发表的CLIP数据分析了这644种mRNA的情况，其中有21种mRNA一直是可以结合IGF2BP2的。circNSUN2与CRC肝转移有关，结合QPCR和Western检测的数据，最终选择HMGA2作为靶分子。RNA pull-down实验证明了circNSUN2的确可以捕获HMGA2 mRNA。干扰circNSUN2后HMGA2 mRNA的稳定性显著降低。荧光素酶报告基因实验，免疫荧光-FISH共定位分析证明了circNSUN2/ YTHDC1/IGF2BP2复合体与HMGA2 mRNA的结合。IGF2BP2分段突变和circNSUN2干扰等实验进一步证明了他们相互作用的位点和序列信息。

图6  circNSUN2/ YTHDC1/IGF2BP2复合体功能 （[1]）

体内实验证明HMGA2是circNSUN2调控CRC肝转移的介导者

最后，作者在体内模型中验证了上述分子模型与CRC肝转移的相关性。单独干扰circNSUN2可抑制肝转移，但如果同时过表达HMGA2则促进肝转移。

图7 体内模型证明circNSUN2通过HMGA2促进CRC肝转移 （[1]） 

本文的故事非常精彩，有几个值得学习的思路总结如下：

1. 从已知的疾病相关CNV位点（很可能是肿瘤的驱动基因所在的位置）出发收缩circRNA筛选的目标，这样可能有助于找到对疾病发生发展关系更紧密的分子。

2. RNA Pull-down找到了circRNA相互作用的蛋白，是揭示circNSUN2分子功能的关键一步。

3. 通过circNSUN2的相互作用蛋白的捕获，发现了m6A的Reader蛋白YTHDC1，进一步发现了circNSUN2出核的机制。本文最初并不是要分析circRNA的m6A修饰的，互作蛋白的捕获帮助作者发现了circNSUN2的m6A修饰对它出核的作用。

总之，本文的工作非常精彩，从小样本临床标本的分析入手，找到CRC肝转移相关的circRNA分子，然后基于RNA Pull-down分析，发现了circNSUN2的相互作用蛋白YTHDC1和IGF2BP2，进而从干扰circNSUN2前后转录组差异分析结合作者所发现的现象找到HMGA2 mRNA是circNSUN2促进CRC肝转移的介导分子，故事前后逻辑衔接非常通顺，是circRNA机制研究的重要参考工作。

参考文献：

1.Ri-Xin Chen, X.C., Liang-Ping Xia, Jia-Xing Zhang, Zhi-Zhong Pan, Xiao-Dan Ma, Kai Han, Jie-Wei Chen, Jean-Gabrie Judde, Olivier Deas, Feng Wang, Ning-Fang Ma, Xinyuan Guan, Jing-Ping Yun, Feng-Wei Wang, Rui-Hua Xu, Dan Xie N6-methyladenosine modification of circNSUN2 facilitates cytoplasmic export and stabilizes HMGA2 to promote colorectal liver metastasis. Nature Communications, 2019.

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