深度长文『中』|2019年度circRNA研究盘点

2.6 circRNA降解机制研究进展

circRNA的降解机制此前的研究相对薄弱，2019年在circRNA降解机制方面有了很大的进步，首次报道m6A修饰可以通过募集RNase P/MRP复合物介导RNA的切割和降解，这一机制的底物可以是线性RNA，也可以是circRNA，此外还报道发现了果蝇GW182可以介导circRNA的降解，人类的三个同源基因（TNRC6A、TNRC6B和TNRC6C）也具有降解circRNA的作用。

m6A通过募集RNase P/MRP复合物介导circRNA降解

2019年4月2日，Molecular Cell杂志在线发表了一篇有关RNA降解的文章，介绍发现一种m6A介导的RNA降解机制。m6A识别蛋白YTHDF2结合靶分子，并募集HRSP12，进而介导RNA内切核酸酶RNase P/MRP复合物切割靶分子。这一过程可作用于mRNA和circRNA（[19]）。文章的通讯作者是韩国高丽大学的Yoon Ki Kim。

图18 m6A通过介导线性RNA和circRNA降解的机制 （[19]）

果蝇GW182可调控circRNA的降解，人类的同源基因也有相似功能

2019年9月17日，Nature子刊Cell Discovery在线发表了一篇circRNA降解机制的研究论文，报道发现GW182介导circRNA的降解作用。作者基于RNAi文库技术在果蝇DL1和S2细胞中进行筛选分析，文库由靶向31种已知的RNA代谢和降解作用有关的基因构成。通过QPCR检测dati和laccase2基因的线性和环状RNA的稳定性状态的结果来分析靶分子是否参与circRNA的降解作用。最终发现GW182具有介导circRNA降解的作用。人类基因中GW182的同源基因有三个：TNRC6A、TNRC6B和TNRC6C。分别干扰三种基因后均可显著富集circRNA，说明TNRC6A/B/C均参与了circRNA的降解作用（[20]）。文章的通讯作者是重庆大学黄川教授。

图19 人类TNRC6A、TNRC6B和TNRC6C可介导circRNA降解 （[20]）

2.7 circRNA与免疫效应

免疫系统是机体抵御病原体侵害的重要保障，很多病毒基因组以RNA形式存在，机体抵御外源RNA分子的免疫效应机制是一个重要的科学问题，目前已知机体主要通过RIG-I，TLR-3/7/8等受体对外源RNA分子进行识别，随后激活免疫系统，达到清除病毒的作用。circRNA作为常见的RNA分子形式，在免疫通路中如何发挥作用此前还没有系统的研究报道。2019年关于circRNA与免疫效应关系的研究取得了不小的进展，包括首次报道发现circRNA特定结构在先天免疫调控中发挥重要作用，外源合成circRNA诱导细胞免疫效应通路激活机制的发现。

circRNA调控天然免疫通路

2019年4月25日，Cell杂志发表文章介绍发现circRNA参与细胞抗病毒免疫效应机制，该机制在系统性红斑狼疮等自身免疫疾病中发挥特殊作用。文中作者发现许多circRNA倾向于形成16-26bp不等的小颈环结构，该结构可结合并抑制双链RNA依赖性蛋白激酶R（double-stranded RNA-activated protein kinase，PKR），当细胞受到poly(I:C)刺激处理或病毒感染时，核酸内切酶RNase L激活并降解circRNA分子，PKR被释放并激活下游抗病毒效应机制。系统性红斑狼疮（Systematic lupus erythematosus，SLE）患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中circRNA总体降低，PKR活性紊乱，但人为过表达circRNA有助于降低SLE患者PBMC中PKR的活性，将来或许有助于SLE等自身免疫疾病的治疗（[21]）。文章的通讯作者是陈玲玲教授，杨力教授和上海交通大学医学院附属仁济医院沈南教授。

图20 circRNA特殊结构调控天然免疫效应通路 （[21]）

外源circRNA与免疫效应通路的关系

早在2017年，Howard Y. Chang就曾经在Molecular Cell杂志报道细胞可以通过RIG-I识别细胞内生成的circRNA（内源circRNA）和体外合成环化的circRNA（外源circRNA），RIG-I识别外源circRNA后可激活自身免疫效应通路（[22]）（推荐阅读：Molecular Cell | 细胞识别内源/外源circRNA的机制）。然而2019年3月19日发表在Molecular Cell的一篇文章却给出结论，外源合成的circRNA不诱发免疫效应通路，是很好的表达蛋白的工具（[23]）（推荐阅读：环化的RNA不诱发免疫反应，且可以高效翻译蛋白），这篇文章的通讯作者是麻省理工学院的Daniel G. Anderson教授。

但随后在8月30日Howard Y. Chang团队再次在Molecular Cell杂志发表文章证明了外源合成的circRNA确实可以诱导自身免疫效应相关的通路，他们发现细胞通过识别是否携带m6A修饰来识别内源和外源circRNA，外源的不带m6A修饰的circRNA可以激活内源性自身免疫效应相关的通路（[24]）。

图21 circRNA通过RIG-I诱导先天免疫应答分子机制 （[24]）

2.8 circRNA与表观遗传

表观遗传学是调控基因表达的重要机制，circRNA在表观遗传机制中的作用研究相对比较薄弱，2018年曾经有一篇研究文章报道circFLI1可调控启动子的甲基化修饰状态（[25]）。2019年在该方向取得了一些进展，包括发现超级增强子调控circNfix的表达。circHuR等核定位的circRNA通过调控相关转录因子的结合特性调控基因表达。

超级增强子调控circNfix的表达

2019年6月18日，Circulation杂志发表了南方医科大学南方医院宾建平团队的一项研究成果，报道超级增强子调控的circNfix缺失可诱导成年小鼠心肌梗死后心脏再生。该研究鉴定出与心脏再生相关的circRNA：circNfix，转录因子Meis1可结合在circNifx的超级增强子上，促进circNifx的高表达；circNifx表达下调可以促进心肌细胞的增殖和血管生成，而抑制心肌梗死后心肌细胞的凋亡，从而改善心肌功能和预后（[26]）。

图22 circNfix减弱小鼠心肌梗死后心脏再生的作用机制 （[26]）

核定位circRNA调控转录因子结合特性

转录因子结合到基因的启动子区并调控下游基因的表达，一些表观遗传调控的机制就是通过影响转录因子结合能力而实现对特定基因表达状态的调控的，如启动子区的DNA甲基化，组蛋白的甲基化，乙酰化等修饰状态。一些非编码RNA也可以通过影响转录因子的结合特性调控相关基因的转录状态，因此也是表观遗传调控的一种机制。2019年多篇文章报道circRNA也可以通过影响转录因子的结合特性实现对一些基因的表达状态调控，因此可以认为这些circRNA也参与了表观遗传行为。

2019年7月19日，Molecular Cancer杂志发表了桂林医学院附属医院Li Bin为通讯作者的文章，介绍环状RNA circRHOT1通过启动NR2F6表达促进肝细胞癌的进程。作者基于在线数据分析和验证，发现circRHOT1在HCC中显著上调。研究者用生物素标记的circRHOT1特异性探针进行RNA pulldown实验，发现circRHOT1将TIP60募集到NR2F6启动子区并启动NR2F6的转录（[27]）。

2019年11月13日，华中科技大学同济医学院附属协和医院的童强松教授和郑丽端教授团队在Molecular Cancer杂志上发表了一项circRNA的研究工作，报道Circ-HuR（hsa_circ_0049027）可以与CNBP结合并抑制其与HuR启动子的结合，从而导致HuR的下调（[28]）。

图23 circ-HuR结合CNBP阻止其与HuR启动子的结合 （[28]）

2019年11月11日，EMBO Molecular Medicine杂志在线发表了华中科技大学同济医学院附属协和医院的童强松教授和郑丽端教授团队的一项circRNA研究工作，报道转录因子CUX1来源circRNA（circ-CUX1）通过与EWS RNA结合蛋白1（EWSR1）结合并促进EWSR1与MAZ（MYC-associated zinc finger protein）的相互作用，从而促进神经母细胞瘤细胞的有氧糖酵解，生长和侵袭，从而导致MAZ反激活以及 CUX1和其他与肿瘤进程相关的基因的转录变化（[29]）。

图24 circ-CUX1结合EWSR1，促进后者与MAZ的结合 （[29]）

 3

人类疾病相关circRNA主要进展概述

3.1 肿瘤相关circRNA研究进展汇总

肿瘤一直是circRNA研究最活跃的疾病类型，2019年circRNA的研究论文和国家自然科学基金项目中，肿瘤学依然是绝对的主角。由于肿瘤相关circRNA研究体量非常巨大，完整的汇总需要非常大的篇幅，在此仅选择几项比较有代表性的研究工作：

肿瘤相关circRNA表达分析

2019年2月7日，Cell杂志在线发表了美国密歇根大学的Arul M. Chinnaiyan教授团队是一项工作，从外显子芯片数据分析了2000例，26种肿瘤中circRNA的表达情况，汇总形成了人类泛肿瘤circRNA表达数据，并构建了数据库：

MiOncoCirc（https://mioncocirc.github.io/）（[5]）。

图25 人类泛肿瘤circRNA表达数据库 （[8]）

circMYBL2是FLT3-ITD型AML潜在的治疗靶点

2019年8月18日，血液学顶级杂志Blood发表了一篇circRNA的研究论文，报道在FLT3-ITD型急性髓系白血病（AML）中circMYBL2通过结合PTBP1促进FLT3蛋白翻译。文章的通讯作者是中山大学的陈月琴教授。

FLT3-ITD是在FLT3基因中间的一段串联重复序列突变，该突变可导致Y591的自磷酸化，进而激发下游通路的过度激活，最终促进白血病的进程。FLT3-ITD突变型的AML病人预后较差且容易复发。FLT3的抑制剂可缓解这类白血病患者病情，但往往会因为FLT3基因的二次突变而导致耐药。因此，依然需要开发FLT3突变AML疾病新的治疗靶点。本文基于GEO数据分析，筛选到来自MYBL2基因的一个circRNA分子（circMYBL2），circMYBL2可以特异性的在FLT3-ITD阳性的AML细胞系中促进细胞增殖。机制方面，circMYBL2可通过结合PTBP1促进FLT3蛋白的翻译效率，进而促进疾病进程。有趣的是，作者的结果表明干扰circMYBL2对于FLT3抑制剂耐药的细胞也是有效的，说明circMYBL2是一个潜在的FLT3-ITD AML的治疗靶点（[30]）。

图26 circMYBL2结合PTBP1促进FLT3蛋白翻译 （[30]）

Hepatology杂志发表多篇肝癌相关circRNA文章

2019年著名肝脏学杂志Hepatology发表了多篇circRNA的研究论文，报道肝癌相关circRNA的研究。

2019年4月20日， 南京医科大学附属鼓楼医院姜润秋和东南大学医学院王学浩为共同通讯作者在Hepatology在线发表了一项肝癌circRNA的文章，介绍发现circMAT2B通过调控miR-338-3p影响PKM2，促进肿瘤细胞糖酵解效应和肿瘤恶变（[31]）。

图27 circMAT2B与糖酵解有关 （[31]）

2019年5月30日，第二军医大学东方肝胆外科研究所的王红阳院士和Li Liang研究员在Hepatology杂志发表文章，报道发现Circ-CDYL在肝癌早期诊断中的价值。作者对早期肝癌组织进行全面的mRNA, circRNA和microRNA表达谱分析，筛选到在早期肝癌中特异性表达上调的Circ-CDYL，体内和体外实验验证了Circ-CDYL调控 HDGF下游的NCL-PI3K-AKT和HIF1AN下游NOTCH2信号通路的活化，上调致癌蛋白c-myc和SURVIVIN表达，促进早期肝癌的发生发展。结合临床样本分析，验证联合Circ-CDYL、HDGF 和 HIF1AN三个生物标志物可有效诊断早期肝癌，提高了其诊断的灵敏性和特异性（[32]）。

图28 Circ-CDYL联合HDGF、HIF1AN分子诊断早期肝癌（[32]）

2019年12月15日，复旦大学附属中山医院肝癌研究所周俭教授在Hepatology杂志发表文章，报道发现CircASAP1是肝细胞癌转移的关键调节因子。作者发现circASAP1与HCC患者根治性切除术后的肺转移有关，在miR-326 / miR-532-5p-MAPK1 / CSF-1信号转导中起着重要作用，可作为HCC患者的预后预测指标（[33]）。

图29 CircASAP1在HCC中的表达与作用机制 （[33]）

肠癌相关circRNA组合标志物cirScore

2019年9月2日，EMBO Mol Med在线发表一篇circRNA文章，来自中山大学附属肿瘤医院的研究团队采用高通量测序数据系统的鉴定和筛选了一批可用于中期结肠癌复发预测的circRNA，并在第三方数据中得到验证。中山大学附属肿瘤医院的徐瑞华教授为该文章通讯作者，鞠怀强副研究员，赵齐博士、王峰副主任医师、王梓贤博士及中山大学附属第六医院的兰平教授为文章共同第一作者。作者将筛选的circRNA进行线性组合，利用训练数据集构建了基于circRNA预测中期结肠癌复发的分子标签cirScore。性能评估表明，该指标可以在结肠癌患者中有效区分高危复发组和低危复发组。此外，作者还收集了本院122例和来自中山大学附属第六医院的180结肠癌病人样本作为内部验证集和外部验证数据集对标签性能进行验证。结果显示，该指标可以在外部的数据集中得到验证。通过比较，作者发现高cirScore的患者复发风险是低cirScore的2倍以上。且高cirScore的患者总生存期也显著长于低cirScore患者（[34]）。

图30 cirScore用于肠癌临床预后分析 （[34]）

3.2 心血管疾病相关circRNA研究进展汇总

2019年circRNA在心血管疾病方面也有一系列进展，下面选取几个有代表性的研究工作进行介绍：

circ_Lrp6调控VSMCs的功能

2019年2月15日，Circulation Research在线发表了意大利Humanitas Research Hospital的Gianluigi Condorelli和Leonardo Elia为共同通讯作者的文章，报道发现在血管平滑肌细胞（VSMCs）中Lrp6来源的circ_Lrp6可以通过竞争性结合miR-145上调其靶基因ITGβ8, FASCIN, KLF4, Yes1和Lox的表达，影响血管疾病的发病过程。在小鼠和人的血管疾病过程中，miR-145和circ_Lrp6的表达水平是存在差异调控的，而调节circ_Lrp6的表达可以影响到血管疾病的发展。在VSMCs中，circ_Lrp6具有促细胞增殖的效应，而miR-145具有促细胞分化的效应。当血管疾病发生发展的时候，内膜增生，血管平滑肌细胞中的miR-145表达下调，circ_Lrp6的表达可不发生改变。而当人为地敲低circ_Lrp6的表达，则上调miR-145的表达，进一步抑制内膜增生的程度，抑制血管变窄导致的后续血管疾病的发生发展（[35]）。

图31 Circ_Lrp6的组织表达和调控 （[35]）

circFndc3b促进心肌修复

2019年9月20日，Nature Communications期刊在线发表了美国费城天普大学Raj Kishore为通讯作者的文章，报道发现在发生心肌梗死MI的小鼠心脏中表达出现明显下调的circFndc3b，体内和体外结果均显示circFndc3b过表达有助于减轻心肌细胞和内皮的凋亡，改善心肌功能。进一步的机制研究，证明circFndc3b并不作为miRNA的海绵而发挥功能，而是与RNA结合蛋白FUS相互结合，正向调控VEGF-A的表达，从而改善梗死后心肌的功能和重建（[36]）。

图32 circFndc3b介导的心脏修复的机制 （[36]）

cPWWP2A改善糖尿病引起的视网膜血管病变

2019年4月9日，PNAS杂志在线发表了复旦大学上海医学院附属耳鼻喉眼科医院颜标研究团队的一项研究成果，报道发现cPWWP2A可以改善糖尿病引起的视网膜血管病变。该研究显示糖尿病应激上调视网膜周细胞，而不是内皮细胞中cPWWP2A的表达水平。体外研究表明，cPWWP2A充当内源性miR-579的海绵，调控Angiopoietin 1/Occludin/SIRT1基因的表达，直接调节周细胞生物学功能，而通过携带cPWWP2A的外泌体间接调节ECs生物学功能，促进ECs的迁移和血管形成能力。体内研究表明，cPWWP2A过表达或抑制miR-579表达可减轻糖尿病引起的视网膜血管功能障碍。相反，抑制cPWWP2A表达或过表达miR-579会加重视网膜血管功能障碍。这项研究揭示了周细胞和ECs “对话”的新机制，干预cPWWP2A或miR-579的表达可为治疗糖尿病微血管并发症提供治疗策略（[37]）。

3.3 其他人类疾病相关circRNA研究进展汇总

除了肿瘤和心血管疾病，其他类型的人类疾病也有不少circRNA的研究工作，也是由于体量较大，这里仅选择在神经性疼痛中探索circAnks1a机制的研究工作，这个故事中circRNA既有miRNA Spong的功能，也可以结合蛋白，因此是非常有趣，也非常典型的circRNA研究工作，因此选这个文章给大家做介绍。

circAnks1a在神经性疼痛中的作用

2019年9月11日，Nature Communications在线发表了一篇circRNA的研究文章，报道脊髓中circAnks1a在神经性疼痛的啮齿类模型中调节超敏反应。文章的通讯作者是中山大学医学院信文君教授，徐婷和中山大学孙逸仙纪念医院马超教授。本文主要基于大鼠脊神经结扎的模型分析了差异变化的circRNA，找到了circAnks1a，并验证了circAnks1a与神经性疼痛的相关性。机制方面作者发现circAnks1a可以促进YBX1的入核和结合VEGFB启动子，促进其表达，还可以通过竞争性结合miR-324-3p调控VEGFB的表达。两种机制共同促进了VEGFB的表达，最终介导神经性疼痛的生理过程（[38]）。

图33 circAnks1a的验证和分析 （[38]）

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