“circRNA研究如何创新”系列课程热点问题解答

吉赛课堂“circRNA研究如何创新”系列课程受到了大量认可和关注，学员们非常踊跃提问交流，但由于时间有限，很多学员关心的问题没有及时在课堂上做出解答。我们整理并精选了15个最受关注的热点问题，主讲老师刘景磊博士进一步做了详细的解答，在此一起与大家交流分享：

1

问

请问对于sponge机制，circRNA上AGO2 的结合位点，与miRNA在circRNA上的结合的位点有必要重合吗？

答

RNAi 机制中siRNA通过与靶分子RNA的互补诱导RISC复合物结合并切割靶分子RNA，AGO2是其中切割靶分子的酶。在miRNA研究中AGO2与miRNA互作后结合到mRNA等上面，但是否基于此作用切割靶分子还可能存在其他未知的机制。miRNA Sponge模型中，很多的研究都报道通过anti-AGO2的RIP实验同时捕捉到了miRNA和circRNA分子，但他们之间的结合位点是否完全重合目前还没有见到相关的文献报道。要证明miRNA Sponge、miRNA和circRNA的相互作用是必须的一个证据，至于三者之间的结合位点是否一致还不好确定。

2

问

环状RNA可以不通过RNA结合蛋白，而直接与下游的功能蛋白结合吗？

答

与环状RNA结合的蛋白不一定是目前定义的RNA结合蛋白（RBP），很多并不是RBP的蛋白也可以通过与circRNA结合发挥作用，比如2019年报道的circACC1与AMPK激酶亚基的结合，早期杨柏华教授报道的circAmotl1与c-Myc、STAT3、PDK1、AKT1等蛋白的相互作用等等，这些蛋白目前都不是RBP。这些研究均表明circRNA可以直接通过与其他蛋白的结合影响和调控后者的功能。

3

问

网站上预测出的RBP是结合在circRNA的侧翼上，请问这个有没有什么意义？

答

这些预测结果是为帮助找出这个circRNA侧翼内含子中RBP结合的情况，这个信息可以帮助分析潜在的介导circRNA生成的RBP蛋白。目前关于circRNA形成的机制研究还比较有限，其中很重要的一类是通过侧翼内含子中结合的RBP介导的。这个信息会对这个研究思路提供一些线索。

4

问

不做疾病方面的研究还能做m6A吗？比如我做的是机体发育，比方说肌肉发育。

答

RNA的m6A修饰是广泛存在的，已经报道的文章表明RNA的m6A修饰和发育，分化，疾病的发生发展都会有很多联系，不同的m6A修饰酶，去修饰酶，Reader蛋白的表达状态，甚至它们的特殊定位机制都会影响RNA的m6A修饰状态有关。RNA的m6A是一个高度动态可变的过程，特定RNA分子以及总RNA的m6A修饰状态的变化的机制和生理病理作用还有很多值得探索的问题。

5

问

环状RNA修饰之后会不会对它的功能产生影响？比如说吸附miRNA、翻译蛋白等。

答

circRNA与蛋白，miRNA分子的相互作用是高度动态的，circRNA发生了m6A修饰后究竟会怎样影响和调控circRNA的功能和互作模式的认识几乎还是一片空白。但几篇已报道的circRNA m6A修饰文章给出了一些暗示信息，比如m6A修饰可以帮助circRNA募集核糖体并启动ORF的翻译，circRNA的m6A修饰有助于其出核。也可能会进一步影响其亚细胞定位，但目前还没有这方面的报道。线性RNA中m6A修饰并不影响碱基配对的方式，但对两条链的结合作用力有一些影响。m6A修饰是否会影响circRNA与miRNA的相互作用，会不会改变circRNA自身的结构状态也是值得探索的问题。circRNA在发生m6A修饰前后肯定会有不同层面的影响，最简单的，circRNA有了m6A修饰后就可以募集m6A的Reader蛋白，由此产生一系列特殊的相互作用改变。

6

问

所有的circRNA都有m6A修饰吗？还是必须有motif才可以？

答

不是所有circRNA都有m6A修饰，这个问题有两个层面。首先目前对RNA中m6A修饰的位点做了统计分析，几乎所有的m6A修饰都发生在“RRACH”的motif里（R=A/G，H=A/C/U），这个motif的A碱基都有可能被m6A修饰的，其他位置的A碱基被修饰的可能性应该是非常小的。RRACH motif只是有m6A修饰的一个前提条件，但不等于一定会被修饰。还跟修饰酶，去修饰酶的表达和定位关系有关。

7

问

怎么判断一个circ是不是有m6A修饰？

答

这个问题可以从生物信息分析和实验验证两个方面来回答。首先可以先看看circRNA的序列中有没有RRACH的motif，这个motif里的A碱基才有可能被m6A修饰。目前对circRNA的m6A修饰谱认识还比较有限，已报道的文章信息也不能代表所有可能的情况，如果想先看看有没有出现过m6A修饰，可以从circBank的信息里检索一下。实验方面，可以设计meRIP 后进行QPCR分析，找出特定circRNA分子在实验体系中是否携带m6A修饰。

8

问

具有翻译潜能的circRNA的长度大小范围大概在多少呢？总长度小于300nt 的有可能翻译吗？

答

理论上符合翻译条件的ORF都能被翻译的，早期的研究中人为定义ORF大于300是因为以前的研究技术太小的多肽不好鉴定，大于100aa的蛋白都还那么多没研究的，还不用太多的考虑小于100aa的多肽。就是这个条件纯粹是人为加上的，没有科学依据。也正是因为这个缘故，现在小于100aa的功能小肽的挖掘分析就显得特别必要。circRNA中也存在可翻译的ORF，理论上小于300的是有可能被翻译的，但circRNA还存在分子内张力的问题，太小的环是否会影响circRNA的结构，并因此影响核糖体的结合也是个问题。但不管怎样，理论上小于300nt的circRNA也是有被翻译的可能的，但是否真的能被翻译，最好是有实验的证据。

9

问

对于含有内含子的circRNA， 其翻译过程中这部分也是被翻译的吗？

答

外显子和内含子是一个RNA剪切前后的问题。这里提到的外显子和内含子是从标准的基因注释信息里定义来的，这里的内含子认为是不会在成熟的mRNA中出现的序列。但多种迹象显示circRNA是可以携带特殊的“内含子”序列的，也就是circRNA会有特殊的可变剪切方式。但无论如何，这些“内含子”只要是被剪切进入成熟的circRNA里面，就不会再有外显子内含子的区别，因此只要能确定是存在成熟的circRNA的序列，都是一样的，如果恰好ORF涵盖了这一段，也是可以被翻译的。

10

问

之前参加会议，有老师说能够翻译的环状RNA的比例不会非常多，大概5%左右。现在在你们看来，环状RNA翻译这方面的前景如何？

答

首先这个5%的数据只是片面的数据，目前没有关于circRNA有多少可被翻译的科学统计数据，都是主观猜测的，可能更少也可能更多。circRNA中蛋白翻译有很特殊的机制和条件，由IRES或m6A修饰启动翻译，目前关于circRNA中如何起始和终止蛋白翻译的机制认识还日常有限，有证据显示热激刺激能促进circRNA的翻译，应该还有非常多的未知机制来调控circRNA的翻译。circRNA中是否有非AUG起始的ORF也是完全未知的问题。因此，目前究竟有多少circRNA可以被翻译，如何被翻译的都是完全未知的问题。circRNA的翻译还可能存在组织或疾病特异性的特征，就是在这个组织里能被翻译，在其他组织里不一定。所有这些问题都需要进一步的探索分析。关于circRNA翻译有没有前景，这个问题我觉得可以这样去理解，自然界存在的东西都是有原因的，circRNA发挥功能的途径也不会是一个模子，我们要认识circRNA的功能就需要多方面探索，翻译只是探索circRNA功能机制的一个思路，能走多远还是要从分子本身的功能特点来分析。但这么多的circRNA，还可能存在组织特异性的翻译机制，相信会有大量的circRNA翻译相关的课题值得去探讨。

11

问

如果某一circRNA的预测翻译产物不跨过junction point，就无法自制抗体，如何选择商业抗体？

答

这个问题也不是绝对的。我在课程里曾给大家讲过Frame的定义，任何一段核酸序列都有三个编码蛋白的Frame，不跨过junction point，也不等于一定会跟母基因同一个Frame，同样的序列，如果不是同一个Frame，还有可能存在全新的蛋白序列的。即使是跟母基因同一个Frame的产物，序列也一致，只是因为没有跨过junction point，所以不太适合设计特异性的抗原识别表位，因此不太方便做自制抗体。有一个可行的方案是从商业化的抗体来找。如果存在刚好能识别这一段序列的商业化抗体，则可以通过WB结果中分子量不同的条带，先预测一下circRNA的ORF产物的分子量，从商业化抗体给出的WB图或者自己跑出来的结果中预测可能的条带，干扰或过表达circRNA后看对应条带的变化也可以给出一些检测目的产物的方法。当然如果没有商业化的抗体，单独设计这一段的抗原自知抗体去同时检测母基因和circRNA翻译产物也完全可以，但需要注意同原蛋白的问题。这种情况选择商业化抗体或自制抗体需要考虑抗体识别表位的信息，保证这个表位的特异性，然后就是分子量要分析清楚。

12

问

在circbank上发现有circRNA有ORF和IRES，我能不能直接做这个circRNA，直接上实验吗？怎么做？

答

为方便大家预测分析circRNA的翻译潜能，circBank利用CPAT工具分析了所有circRNA序列经过四次拷贝后的序列中ORF的信息，基于IRES Finder工具预测了IRES的情况，还整理了m6A修饰的信息，这些都可以作为circRNA翻译评估的佐证信息。但有几个问题需要注意，CPAT工具是从线性RNA的信息汇总的结果得出的，在lncRNA的预测分析中有一定的效用，但目前对circRNA翻译机制的认识太少，没法直接总结出专门适合circRNA的翻译评估体系，只能间接的用线性RNA的工具来做，因此这个报告中的ORF是否是circRNA上最可能被翻译的ORF还不能确定，因此其他的ORF也要考虑。IRES Finder工具预测IRES 也是同样的道理，circRNA与线性RNA的IRES是否一致还很难讲，有些证据显示两者可能还不太一样，那么什么IRES能在circRNA中发挥作用目前也没法得出科学的结论。还有circRNA翻译也可能存在组织特异性的问题。因此有了预测结果只能说存在能被翻译的可能，无论如何，都需要验证一下是否真的可以被翻译。面对这样的情况，用低成本实验先做一下初步的判断是挺有必要的，一个选择是从已有的商业化抗体看有没有能识别这个位置这段序列的抗体，所提供的WB结果有没有和这个ORF分子量接近的“杂带”，如果有，可以设计干扰或过表达实验验证这个条带与circRNA表达量的关系。另一个选择是直接设计融合Flag的载体验证是否被翻译，N端，C端，中间融合都可以试，主要是验证能否被翻译，对应的ORF突变设计，IRES突变或删除设计也可以一起做做。circRNA翻译蛋白最关键的一步就是尽可能用严谨的实验证明蛋白产物是circRNA翻译出来的，内源蛋白产物验证也非常关键，能证明所预测的蛋白是天然存在的才能进一步探索其机制。此外，目前已经提交的蛋白质组学质谱数据挖掘，翻译组学数据挖掘也是可以考虑的思路，但能否恰巧找到所感兴趣的分子也需要运气。

13

问

Pulldown+质谱得到与circRNA结合的蛋白后，一般会比较多，如何进一步筛选以及功能研究？

答

circRNA Pull-down后往往会得到几十到几百个互作蛋白的信息，如何选择下一步验证的蛋白是个比较有挑战性的工作。Pull-down实验有一定的假阳性和假阴性的问题，可以通过所捕获的蛋白的通路富集，蛋白家族富集以及蛋白互作网络预测等工具综合评估，一般会发现一些比较强富集的蛋白复合体或通路，从这个入手可能会找到更有价值的互作蛋白信息。

14

问

亚细胞定位主要在胞核内的RBP可以和胞浆内的circRNA互作吗？

答

也是有可能的，杨柏华教授就曾经报道circAmotl1可以与c-Myc，STAT3，PDK1，AKT1等蛋白相互作用，这些蛋白存在胞质-核穿梭定位的现象，circRNA与它们相互作用也可能会影响他们穿梭定位的效率。因此这个是有可能的。

15

问

有的老师强烈建议用RNase-assisted  RNA chromatography 去验证circRNA与RNA结合蛋白之间的作用关系，这个方法可以么？与RIP和pull down方法相比较的特点是什么？

答

RNase-assisted  RNA chromatography 是比较有效的捕获和验证结合蛋白的工具，但目前在circRNA互作蛋白的研究中用的比较少，这个方法完全可以用在circRNA相互作用蛋白的研究的。但这个技术需要用到高纯度的待研究circRNA分子，通过比较RNase消化前后被捕获蛋白的差异条带，能比较有效的得到由于RNA被消化而特异性洗脱出来的蛋白组份，这些就很可能是与靶分子RNA结合的蛋白。该技术可能比传统的RNA Pull-down得到的互作蛋白更准确一些，但有两个方面的问题需要注意，一是该技术属于体外研究RNA-蛋白互作的技术，细胞经过裂解后所有的蛋白都要跟RNA分子接触，这样有些细胞内不存在共定位条件但可以相互作用的蛋白也会被这种方法检测到。另一方面，这个技术需要提前准备纯化的circRNA分子，还需要对RNase消化条件进行摸索，实验条件的要求比较高。传统的RNA Pull-down和RIP也各有优劣。大家往往是已经知道了某个circRNA分子，需要找出相互作用的蛋白，因此第一步初筛的时候往往基于RNA Pull-down后质谱鉴定，然后再通过RIP反向验证的思路来做。其中RNA Pull-down有反义探针法和RNA标签法。RNA标签法比较容易操作，设计也更加灵活，非常适合第一步的初筛分析。

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