CRISPR-Cpf1应用再添新的里程碑—Cpf1成功治疗杜氏肌营养不良疾病

导语

自2012年以来，CRISPR-Cas系统被广泛应用到生命科学研究各个领域中，短短几年内，CRISPR-Cas技术凭借其强大的功能及便捷性，迅速席卷了整个生命科学研究领域，并且掀起了一场革命性的巨变。科学家们借助该技术能以前所未有的精度及速度，对各种生物体的DNA作出编辑。

4月12日，Science Advance杂志在线发表了一篇标题为“ CRISPR-Cpf1 correction of muscular dystrophy mutations in human cardiomyocytes and mice ”的研究论文，首次报道了利用CRISPR-Cpf1在人类细胞和疾病模型小鼠中实现高效的基因修复。

CRISPR家族新成员—Cpf1蛋白

虽然近几年CRISPR-Cas赢得盆钵盈满，但在将其推向人类疾病治疗临床应用过程中依然存在一些问题，例如传递方式和效率，脱靶效应及同源重组效率等。因此，许多科学家仍致力于不断完善CRISPR-Cas技术，以达到在疾病治疗中广泛应用的目的。

2015年4月：麻省理工学院Broad研究所张锋研究小组在Nature杂志公布了一项研究成果，其研究团队在金黄色葡萄球菌中发现了一个更小版本的Cas9—SaCas9。这种小号Cas9酶能更容易地进入细胞，并能降低Cas9体内传递的难度，而这些问题恰是目前spCas9应用的瓶颈所在。虽然SaCas9相对于SpCas9在病毒载体递送方面体现了优势，但其更长且复杂的PAM序列(NNGRRT)限制了它在基因编辑中的运用。

2015年9月：张锋及其团队又公布了一项振奋人心的新发现—CRISPR家族新成员Cpf1蛋白。这是一种来从Acidominococcus和 Lachnospiraceae菌属中筛选得到的新型导向RNA∶DNA内切酶复合物，可能克服CRISPR-Cas9系统应用中的一些限制，实现更高效安全、精确简单地编辑基因。

张锋指出：“尽管CRISPR比之前的基因编辑方法要简单得多，但是该技术依然存在一些不容忽视问题，尤其是应用到人类疾病治疗中，所以我们一直在优化，甚至寻找能更好地替代CRISPR-Cas9的新技术。”

Cpf1和Cas9相比具有哪些特点

Cpf1的发现和应用为CRSIPR基因编辑技术再添热度。作为一种新的CRISPR家族蛋白，Cpf1既拥有DNA切割功能，同时还展现出许多不同于Cas9的特性，而这些特性也使Cpf1被认为有可能替代目前的Cas9技术，或至少丰富CRISPR系统在转化医学中的应用。以下是Cpf1相比于Cas9所具有的特点：

第一， Guide RNA不同。 Cpf1介导切割时仅需一条较短的单链CRISPR RNA（crRNA）来引导，而Cas9介导切割时则需要crRNA和反式激活crRNA(tracrRNA)的杂合链来引导，因此Cpf1在结构上比Cas9要简单，便于在组装构建。此外Cpf1蛋白小于SpCas9蛋白，这使Cpf1蛋白更易导入细胞和组织中发挥作用。

第二，切割位点不同。Cpf1介导的切割位点远离PAM序列，而Cas9通常被认为在靠近PAM序列的3和4位间发生切割，这种差异使得人们对于编辑位点有更多选择。

第三，切割机制不同。Cas9介导切割后产生的是平末端序列，Cpf1介导切割后产生不对称的粘性末端序列，而粘性末端序列被认为能够更高效地激活同源重组修复机制。

第四，PAM序列不同。Cas9识别富含鸟嘌呤的PAM序列，而Cpf1识别富含胸腺嘧啶的PAM序列，这一特性扩大了CRISPR技术的靶点的选择范围。

第五，RNA切割功能。2016年4月，来自德国Max-Planck感染生物学研究所的研究人员证明Cpf1能够独自地对crRNA前体进行切割加工，然后与成熟的crRNA结合并切割DNA，该成果发表于Nature杂志。

第六，脱靶效率极低。 2016年6月Nature Biotechnology在线刊登了Jin-Soo Kim等人关于Cpf1的研究成果。该研究利用Digenome-seq分析方法在全基因组范围内对比人类细胞中的Cpf1和Cas9脱靶效应，结果证明Cpf1具有高度特异性，几乎没有脱靶效应。

Cpf1介导双链DNA切割的原理

—Zetsche B ,et al. Cell.2015;163(3):759-71

Cpf1在基因编辑方面的应用

Cpf1由于具有不同于Cas9的特性，自被发现起始就备受研究人员关注。

2016年8月，NatureBiotechnology同时在线刊载两篇利用Cpf1蛋白获得基因敲除小鼠的论文。

研究人员分别利用电穿孔递送Cpf1 RNP（Cpf1蛋白和crRNA复合物），显微注射Cpf1 mRNA及crRNA至小鼠受精卵中，最后成功在受精卵中实现基因敲除，其敲除效率为7.7%—75%不等。并且通过全基因组测序分析，未发现有脱靶效应。

而在2017年4月12日关于Cpf1发表的最新论文中，作者选择了杜氏肌营养不良（Duchenne musculardystrophy ,DMD）小鼠模型及该病患者来源的多能诱导干细胞（iPSCs）作为研究对象，首次将Cpf1应用到人类遗传疾病治疗方面。

关于DMD杜氏肌营养不良

一种由抗肌萎缩蛋白编码基因（Dystrophin）突变造成的遗传疾病，因为该基因位于X染色体，所以该病多在男孩中发生。据统计，全球平均每3500个新生男婴中就有一人罹患此病。患者通常在7岁以前就会因骨骼肌不断退化出现肌肉无力或萎缩，导致不便行走。大概在7岁到12岁时，会彻底丧失行走能力，通常到20多岁就会因为心肌、肺肌无力而死亡。目前针对该病，医学界尚无有效疗法。

研究成果

在该实验中，作用选用了由DMD患者成纤维细胞诱导得到的iPSC细胞系（Riken51），该患者由于Dystrophin基因48—50号外显子缺失，导致基因编码框在51号外显子提前终止，不能产生正常的Dystrophin蛋白。

Fig. 1. Correctionof DMD mutations by Cpf1-mediated genome editing.

同时，作者也进行了Cpf1 mRNA及crRNA显微注射实验，在该实验中选择mdx基因突变的肌肉萎缩症疾病小鼠作为研究模型，该疾病由mdx基因第23号外显子中碱基突变造成基因表达提前终止。

实验中同时注射了介导同源重组修复的单链DNA模板（ssDNA），新生小鼠基因测序结果表明，利用Cpf1介导的同源重组修复效率最高达50%。Mdx蛋白表达分析证明，正确修复的小鼠能够正常表达mdx蛋白，且未出现肌肉萎缩症相关病症。

Fig. 2.CRISPR-LbCpf1–mediated Dmd correction in mdx mice.

展望 

该研究证明了Cpf1能够有效地应用于DMD遗传疾病基因治疗，同时也表现出Cas9未能具备的优势，如较小的蛋白结构能与腺相关病毒（AAV）结合，从而在基因治疗的临床应用中发挥更大作用；Cpf1较低的脱靶效应也受到众多科学家的重视，这为Cpf1在生命医学领域不断推进与应用奠定了良好的基础。

基因编辑研究领域大腕儿之一的Jin-Soo Kim认为，多项研究证明了Cpf1优越的特异性，这种新的核酸内切酶将能够更加广泛地用于精确的基因组编辑，并且几乎不会产生意想不到的突变。同时CRISPR-Cpf1技术的应用将是没有限制的，从基因治疗，安全无毒性抗癌药物筛选和干细胞治疗等方法到获得优质高产的牲畜和农产品等，CRISPR-Cpf1技术的应用或许都能获得重大成果。

参考文献

1. Zetsche B, Gootenberg JS, Abudayyeh OO,et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell.2015;163(3):759-71.

2. Kim Y, Cheong SA, Lee JG, Lee SW, Lee MS, Baek IJ, Sung YH. Generation of knockout mice by Cpf1-mediated gene targeting. Nat. Biotechnol. 2016; 34, 808–810 

3. Kim D, Kim J, Hur JK, Been KW, Yoon SH, Kim JS. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nat Biotechnol. 2016;34(8):863-8.

4. Kleinstiver BP, Tsai SQ, Prew MS, Nguyen NT, Welch MM, Lopez JM. Genome-wide specificities of CRISPR-Cas Cpf1 nucleases in human cells. Nat. Biotechnol.2016; 34, 882–887 

5. Tóth E, Weinhardt N, Bencsura P, Huszár K, Kulcsár PI, Tálas A, Fodor E, Welker. Cpf1 nucleases demonstrate robust activity to induce DNA modification by exploiting homology directed repair pathways in mammalian cells. Biol Direct .2016;11:46 

6. Hur JK, Kim K, Been KW. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nat Biotechnol. 2016;34(8):807-8.

7. Zhang Y, Long C,Li H , et al.CRISPR-Cpf1 correction of muscular dystrophy mutations in human cardiomyocytes and mice. Sci Adv. 2017; 3 : e1602814.

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