除了检测细胞周期和凋亡，流式细胞仪用途原来这么多

Original 张颖邦耀实验室 2024-03-27

前言

1969年，一位名为Wolfgang Göhde的科学家研制了世界上第一台商品化的荧光流式细胞仪，从此拉近了我们与细胞之间的距离。这个仪器能够以每秒10,000个细胞（甚至更多）的速度通过仪器的激光束，对细胞多个水平进行检测，如被大家熟知的进行细胞周期、凋亡的检测等，经过几十年的发展，流式细胞术已经愈加完善，它的美好未来似乎才刚刚开始。伴随着横空出世的CAR-T疗法，细胞流式术也扮演着举足轻重的角色。

一

流式小课堂

1. 流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)原理

流式细胞术是一种定量的分析技术，是指利用流式细胞仪检测细胞内特意标记的荧光信号从而测定细胞的多种生化物质（如膜表面手提、抗原、离子或DNA/RNA表达等）特性的方法，同时也可以把具有相同荧光信号特性的某一群或几群细胞从多细胞群体中分离和富集出来的细胞分析分选技术。

2. 流式细胞仪的构造（主要包括5部分）

a) 流动室及液流驱动系统（将细胞单个压入流动式）；

b) 激光光源及光学系统（发出所需要波长的激光）；

c) 光电管和检测系统（将荧光转变为电信号）；

d) 计算机和分析系统（数据分析）；

e）细胞分选系统（灵魂模块—在高压电厂下进行细胞亚群的分离）。

图1 流式细胞仪的基本构造

如下图2是流式一般操作步骤：

先将样本制备成的单细胞样本悬液；
选择合适的荧光抗体对细胞的膜表面、胞内或核染色标记；
根据研究目的不同可将标记好荧光的样本进行分选；
收集到目的细胞进一步进行形态、功能等的研究；也可以进行扩增培养，或流式细胞仪上直接对样本进行分析等。

图2 流式细胞技术示意图

二

流式细胞仪的优势

1.分析速度快：普通流式细胞仪检测5000个细胞/每秒，大型机可达几万个细胞/每秒；

2.荧光检测灵敏度高：单个细胞上＜600个荧光分子，两个细胞间的荧光差＞5%即可区分；

3.前向角散射（FSC）光检测灵敏度高：FSC反映被测细胞的大小，一般流式能够测量到0.2μm-0.5μm；

4.分辨率高：通常用变异系数CV值来表示，流式细胞仪能够达到<2.0%，这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的；

5.分选速度快：流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达98%以上。

三

流式细胞术的应用

流式细胞仪具有单细胞水平检测能力，技术经过49年的发展，如今的流式细胞仪具有更多的可检测荧光参数（从1-2至30个或更多），可同时测量同一个细胞上的所有这些参数。如在细胞结构方面的应用主要包括细胞的大小、颗粒度、表面积、核浆比、DNA含量与细胞周期、RNA含量、蛋白含量等；细胞功能研究方面也大展手脚，如细胞表面（胞浆和核的）特异性抗原、细胞的活性、细胞内外因子、激素结合位点、细胞受体、蛋白质磷酸化、PH值、钙离子浓度等。如下举几个常见应用的例子：

1. 生物细胞学（常被用于细胞周期和细胞凋亡的检测）

细胞周期检测：流式中常用碘化丙啶（PI）与DNA结合，其荧光强度与DNA含量成正比，进而反映细胞的增殖状态。如图4左，检测分析可得到细胞周期的三个时相（G0/G1、S和G2/M期）的细胞数量。

细胞凋亡检测：利用Annexin-V能与PS高亲和力结合的能力，可以区别凋亡及坏死细胞，因此使用结合FITC的Annexin-V和PI，就可以区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。见图4右，Q1区PI单阳性为坏死细胞，Q2区为PI、Annexin-V双阳性细胞群为晚期凋亡细胞，Q3双阴性细胞群为正常细胞，Q4区为Annexin-V单阳性细胞群为早期凋亡细胞。

图4左血细胞的周期分析图4右细胞凋亡

2. 免疫学

流式细胞术在淋巴细胞及其亚群分析中得到广泛的应用，可同时检测一种或几种淋巴细胞表面抗原。如利用细胞特异性表面标记和分泌的细胞因子等划分细胞亚群，可以研究不同情况下机体的免疫状态及特定细胞群体的免疫功能。

如图5，将不同淋巴细胞亚群区分开来，并可计算其比例，如此次检测中T细胞中CD4阳性的细胞比例为17.53%、CD8细胞的占比为8.31%，CD4、CD8双阳的细胞为0.16%；图6：流式检测CD8阳性T细胞亚群被激活后分泌细胞因子IFNγ和TNFa。

图5 T细胞亚群的划分图6 特异性细胞亚群分泌

细胞因子

3. 临床医学

临床医学工作中，流式既可以粗略判断细胞群体的变化，也可以精确检测异常细胞群。

根据细胞的大小和颗粒度对未染色的新鲜血液细胞进行简单的分析：如图7，绿色区为细胞个体较小，直径6-8μm的淋巴细胞，占白细胞总数的20%-30%；蓝色区为体积最大的单核细胞，直径14-20μm，占白细胞总数的3%-8%；紫色区粒细胞细胞核的形态多样，结构相对复杂，占白细胞总数的50%-70%，直径10－12μm。
监测生理过程：如图8，使用流式细胞仪定量检测 CD34+ 造血干细胞的含量（阳性细胞群P2），来决定动员干细胞及采集最佳时间，一般外周静脉血有核细胞中CD34+细胞达到0.001(0.10%）以上时，可以考虑造血干细胞单采术。这也成为监测动员干细胞和计数移植中造血干细胞数量的有效、精确的工具。
图7 血细胞分类图8 CD34+造血干细胞
临床免疫性疾病的辅助诊断：流式最大的优点就是特异性和敏感性都很好，检测速度快。临床可通过分析CD55、CD59在粒细胞、红细胞上的表达情况，辅助诊断再生障碍性贫血、阵发性血红蛋白尿（PNH）；T4和T8淋巴细胞比例改变（T4细胞大量减少）是诊断艾滋病（获得性免疫缺损综合征）的重要特征；还可以通过淋巴细胞亚群检测（免疫功能检测，检测T\B\NK细胞)），判断免疫缺陷病、肿瘤病人化疗后的免疫力、及进行病毒细菌感染后免疫状态的评价等。

4. 流式细胞术在临床免疫治疗的应用

近年来，CAR-T细胞免疫疗法，在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上的显著疗效，使其被认为是最有前景也是最热门的肿瘤治疗方式之一。

在CAR-T细胞制备过程中，流式技术至关重要。如：T细胞亚群是从外周血分离的PBMC，因个体差异其细胞成分差异很大，需经过磁珠或流式分选纯化最终获得100%的T细胞；又如要保证病人使用的为来自自身的细胞，必须通过流式细胞术等手段检测CAR表达，来鉴别其为表达CAR的自身T细胞；CAR-T细胞回输采用剂量分次输注，从小到大（中位数1×10⁸）的方式，将制备好的CAR-T细胞回输给患者，流式细胞精确计数方面有独特的优势；CAR-T回输后有患者出现细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome, CRS），T、B淋巴细胞、NK/T细胞和巨噬细胞等释放大量的细胞因子、趋化因子，而这些炎症介质导致的炎性反应会引起组织损伤，导致微血管病变、心脏衰竭甚至死亡，流式可通过检测免疫细胞及细胞因子、趋化因子等，严密监控患者是否发生CRS及感染。由此可见流式细胞术在CAR-T制备、输注后监测都有着重要的作用。

应用这么广泛的流式细胞技术，大家在实验过程中应该注意什么呢？在流式细胞术中样本处理的质量，是能获得一个完美实验结果的关键，对不同的研究，样本处理要求不同，流式细胞仪的参数设置也是不尽相同，后面我们将介绍各种不同实验中的“流式细胞术样本的制备”及仪器参数设置的注意事项，请大家持续关注哦！

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