在脑部疾病的治疗过程中，血脑屏障 (blood–brain barrier ，BBB) 始终是绕不开的话题。
“它的作用是保护中枢系统，将病毒等对大脑有害的物质隔绝在外。然而，一旦有了脑肿瘤，这道屏障就成了治疗的阻碍”，美国佐治亚理工大学博士生郭宇彤对生辉说道，“血脑屏障由排列很紧密的血管壁细胞组成，这些细胞的致密程度甚至使治疗药物无法穿过它们进入大脑，也就无法进入脑肿瘤。”近日，以郭宇彤为第一作者的研究论文 Single-cell analysis reveals effective siRNA delivery in brain tumors with microbubble-enhanced ultrasound and cationic nanoparticles 发表在 Science Advances 上。该论文详细介绍了美国佐治亚理工大学 George W. Woodruff 机械工程学院和 Wallace H. Coulter 生物医学工程系联合助理教授 Costas Arvanitis 领导的团队结合聚焦超声和纳米技术，将小干扰 RNA（Small interfering RNA；siRNA）药物递送到脑肿瘤的研究过程与成果。图 | 佐治亚理工大学 Costas Arvanitis 教授（右）和第一作者郭宇彤（左）（来源：受访者提供）Costas Arvanitis 的重点研究方向是生物医学超声和图像引导治疗，具体而言是了解超声和超声诱导微泡振动产生的生物学效应。他所带领的实验室目前主要的研究集中在超声对单个与多个细胞的相互作用、超声介导的分子和药物跨过血脑屏障的运转以及血管和组织中的微泡动力学等。近年来，聚焦超声联合造影剂微泡的方式为药物穿过血脑屏障、靶向递送到脑提供了新的途径，但要实现安全、理想的递送，聚焦超声的频率控制、微泡的成分等方面都有待进一步探索和验证。因具有高度特异性、以及抑制或沉默特定基因表达的能力，siRNA 成为药研的重要方向之一，人们正在探索其从源头上阻断疾病发生的可能，其应用于恶性肿瘤等疾病治疗的研究已陆续开展。但 siRNA 本身非常不稳定，在血液中会被核酸酶降解，另外，siRNA 具有负电荷，很难进入到带负电的细胞膜之内，因此，siRNA 药物的递送仍是需要解决的一大难题。“在治疗大部分肿瘤时，大家一般将 siRNA 包裹在纳米粒子中进行递送，提高 siRNA 的稳定性，让它进入到肿瘤细胞中，” 郭宇彤提到，这样既可以保护 siRNA 药物在血液环境中不被降解，同时也为其进入肿瘤细胞提供帮助。在纳米粒子的包裹之下，siRNA 已经可以进入大多数的肿瘤细胞，对其进行治疗。然而，对于血脑屏障保护之下的脑部肿瘤，尽管穿着纳米外衣，siRNA 药物仍很难到达其中。对此，Costas Arvanitis 团队结合了低强度聚焦超声（focused ultrasound，FUS）和超声造影剂 “微小气泡”（Microbubble, MB）的共同作用，为大小适中的纳米粒子包裹之下的 siRNA 药物开辟出了一条进入大脑的 “通路”。郭宇彤说，“在超声的作用下，微小气泡振荡产生的一些机械效应可以‘打破’血脑屏障，使包裹着 siRNA 药物的纳米粒子得以进入脑肿瘤细胞并释放药物，促使肿瘤细胞死亡。”图 | 聚焦超声和纳米技术递送 siRNA（来源：受访者提供）在此次研究中，Costas Arvanitis 团队成功将包裹着具有治疗性 siRNA 药物的纳米粒子通过上述方法送入长有髓母细胞瘤和胶质母细胞瘤的小鼠大脑，并且，siRNA 药物在大脑中实现释放，杀死了脑肿瘤细胞。在穿过血脑屏障的过程中，“微小气泡” 的作用是不容忽视的，“此次研究选用的造影剂为具有脂质外壳的气泡，这可以增加它的稳定性，同时脂质内的气体会使其具有较大弹性，所以在超声的作用下，微小气泡将会做放大缩小的运动，这个过程作用于周围的血管将实现血管壁的拉伸，进而使细胞之间的缝隙变大，纳米粒子得以穿过血脑屏障。”同时，此次研究中使用的纳米粒子也是经过精细设计的。郭宇彤提到，“之前有很多研究可以用超声提高纳米粒子在脑肿瘤中的递送，但始终没有明确如何设计纳米粒子可以使其最大化的进入到脑肿瘤，” 她进一步说道，“我们结合了一些实验，运用了一个数学模型模拟了纳米粒子在超声作用下从血液中进入大脑和肿瘤细胞的过程。我们发现，在超声作用下，40-50nm 带有正电荷的粒子可以最大化进入到脑肿瘤细胞。”而此前的研究中，多使用 50-100nm 的带有负电荷的粒子进行药物递送。“这是首次证明在超声的帮助下，siRNA 药物可以进入脑肿瘤、杀死脑肿瘤细胞。” 郭宇彤表示，这也是我们这次的实验和此前研究的不同之处，此前已有借助超声辅助纳米粒子穿过血脑屏障的例子，但他们没有将具有治疗作用的 siRNA 药物送入大脑及肿瘤。她进一步说道，“虽然此前的研究也将一些化疗药物递送至脑，不过他们是通过宏观方式对药物是否到达脑部进行评估，以小鼠的存活检验药物起效与否。”“这并不能直观地看到药物是否进入了脑肿瘤，以及进入到脑肿瘤的药物是否真的可以促进脑肿瘤细胞的死亡，” 而此次研究中，团队成员通过免疫荧光技术和共聚焦显微镜观测纳米粒子在肿瘤中的分布以及细胞凋亡，“激光显微镜对包裹 siRNA 药物对粒子进入脑肿瘤前后脑肿瘤细胞的生存变化进行监测，激光显微镜下可以看到每一个肿瘤细胞，这样可以为纳米粒子和 siRNA 药物进入大脑、进入肿瘤细胞以及肿瘤细胞的死亡进行更细节性的观察，更确切地证明技术的有效性。”图 | 用 / 不用超声技术将 siRNA 药物送入小鼠大脑肿瘤细胞存活对比该实验中包裹 siRNA 药物的粒子为直径为 40-50nm 的阳离子粒子，是经过严格计算专为穿越血脑屏障设计的纳米粒子。“我们总结了一些纳米粒子递送的研究，此次研究中用数学模型优化了纳米粒子的设计，在一次次数学模型推演中计算出最合适穿过血脑屏障的纳米粒子的大小。此前实验表明，用超声递送纳米粒子穿过血脑屏障，可比纳米粒子只身穿透这道屏障的通过率提升 4 倍，而经过优化的纳米粒子可在脑肿瘤中达到超过 10 倍的粒子聚集。”在这一过程中，纳米外衣既是避免 siRNA 药物在血液中降解的保护罩，同时，也是帮助难以穿过细胞膜的负电荷药物相对顺利进入细胞的最强辅助。另外，超声设备的振荡幅度控制也要极其小心，“振幅过小无法达到预设效果，如果太大微小气泡就会破碎，破碎时产生的猛烈气流会对周围的组织造成伤害。” 对此，郭宇彤团队连接了一个自研的实时监测设备，观察并调节其设计的超声设备的振幅。在上述已经发表的论文中，郭宇彤团队用这种方法在两种肿瘤模型中验证了超声 + 纳米技术可以实现向小鼠胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤的超 10 倍药物递送，从而增加 15 倍肿瘤细胞死亡。现在，他们希望将这种方案用于其他肿瘤的治疗中。另外，他们也在对比不同 siRNA 药物治疗同一肿瘤的治疗效果差异。目前，该技术已在美国和加拿大进行 I/II 期临床试验，不过尚未将 siRNA 药物送入人的大脑，选用的递送物质是荧光标记粒子。“此次试验首要目的是测试聚焦超声结合纳米技术对人体脑组织的安全性，同时也对这种技术下粒子递送的有效性进行测试。”另据郭宇彤透露，她所在团队和神经科医生合作的有关聚焦超声的临床试验文章目前已被美国科学院院刊（PNAS ）接收，即将发表。
https://advances.sciencemag.org/content/7/18/eabf7390