无创染色体筛查：值得期待的胚胎筛查新技术 | 前沿
►全球首个NICS宝宝。从左至右：无锡市妇幼保健医院主任医师许倩、美国科学院院士谢晓亮、无锡妇幼保健院生殖中心副主任蔡立义、南京军区南京总医院生殖中心主任姚兵、亿康基因CEO陆思嘉
撰文 | 彭若诗
责编 | 陈晓雪
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近日，美国科学院院士谢晓亮带领的一个合作团队报告了一种新的无创胚胎染色体筛查（Noninvasive chromosome screening, NICS）技术，只需要在试管婴儿胚胎植入前检测胚胎的培养液中的DNA，就能实现染色体筛查。在无锡妇幼保健院的临床试验中，NICS技术已经成功帮助五位病人生出健康宝宝。2016年9月29日，《美国国家科学院院刊》（PNAS）刊发了这一最新临床的研究成果。
“这一技术应该说对胚胎的安全性，对子代长期的安全性，遗传病的防控都有着重要的意义。”该研究的通讯作者之一、亿康基因公司CEO陆思嘉对《知识分子》说。
►无创染色体筛查（NICS）图示。从体外培养3-5天胚胎的培养液中提取出DNA片段，经MALBAC技术扩增后将这些DNA片段测序并定位到不同染色体上，得到的结果可以用于判断染色体数目。 制图：彭若诗
胚胎染色体异常的风险是高龄女性生育面临的一个重要问题。1996年，美国科学家D.E.Battaglia等人的一项研究表明，20-25岁的女性体内，卵子染色体数目异常的比例是25%，而对于40-45岁女性，这一比例高达79%。染色体异常的卵子受精后，或无法发育成胚胎引起早期流产，或发育成患有唐氏综合征、帕陶氏综合征等严重染色体疾病的胎儿。
随着试管婴儿等辅助生殖技术的广泛应用，临床上已经可以做到对卵细胞体外受精。待受精卵发育成胚胎后，选择染色体数目正常的胚胎植入准妈妈体内。这一技术叫做植入前胚胎遗传学筛查（Preimplantation genetic screening，PGS），即通过检测染色体的数目和结构，分析胚胎是存在遗传物质异常。PGS 可以显著提高胚胎移植的临床妊娠率、降低流产率。
不过，目前临床采用的PGS技术采集标本时需要侵入式的活检：当胚胎发育到8细胞期时，从中取出1只细胞检测染色体数目。如果正常，还需在胚胎有200多只细胞时，再取3-5只检测确认。这种方法可能对胚胎质量和发育水平造成潜在的影响。谢晓亮等人的论文中指出，虽然目前仍然缺乏对人类胚胎活检长期影响的评估，但是一些动物研究已经表明胚胎活检对神经和肾上腺的发展存在负面影响。同时，活检对医疗人员技术要求很高，需要接受过特殊训练且经验丰富的胚胎学专家进行，这显著增加了PGS用于临床的成本。
因此，“一个无创而又易于操作的筛选工具将极大地促进胚胎植入前染色体筛查的推广，从而提高试管婴儿的成功率”，该研究论文介绍说。
2013年，意大利研究者Paola Scaruffi团队报道，在体外培养试管婴儿胚胎时，培养液中存在少量游离的基因组和线粒体的DNA，这些DNA很可能来源于胚胎自然发育过程中凋亡的细胞。研究者们立即想到，如果能够从这些培养液中的DNA中提取出染色体数目的信息，用于判断胚胎中染色体数目，就可以实现对胚胎的零伤害，即无创染色体检测。
实际上，这一思路虽然清晰，但在实际操作中依然面临着巨大的挑战。陆思嘉介绍说，胚胎外培养液中可获得的DNA数量很少，而且是碎片化的，“因此需要用一种非常好的DNA扩增技术，这也是为什么使用MALBAC这种单细胞扩增技术来做NICS”。
“多重退火环状循环扩增法”（MALBAC）是2012年谢晓亮在哈佛的实验室发明的一种新的单细胞扩增方法。与传统1变2、2变4的链式扩增不同，MALBAC每次都只对原始模板扩增，因此，一次复制出错对整体产物质量没有显著影响。“哪怕单个细胞的30亿个碱基对里有一个碱基错了，我们都能看出来，而且没有假阳性。这种方法比此前广泛应用的MDA（多重置换扩增）方法能更准确地检测点突变和拷贝数变异。”2015年7月，谢晓亮在未来论坛举办的一个报告上介绍说。值得注意的是，本次研究的通讯作者之一陆思嘉正是MALBAC的主要发明人之一。
据论文报道，征得捐献者同意后，研究者在体外通过人工受精制造出42个胚胎，在这些胚胎发育到第3天至第5天时，取出培养液，扩增其中的DNA片段，并将各片段通过序列比对定位到不同染色体上。通过不同染色体上片段数目的多少，来判断胚胎中染色体数目。作为对照，研究者将这42个胚胎中DNA提取出，检测其中实际染色体数目，与从培养液中DNA判断出的比较。结果表明，培养液中DNA检测方法成功判断出了21个染色体数目正常的胚胎和15个染色体数目不正常的胚胎，准确率达84%。剩下的6个错误判断中，有4个是正常胚胎被误判为不正常（假阳性），这可能是胚胎发育过程中自发排出了分裂异常的细胞导致。另外有2个染色体数目不正常的胚胎被误判为正常（假阴性），可能来自父亲或母亲正常细胞的污染。相对于目前活检技术95%的准确率来说，这一准确率虽然较低，但由于无创性，可以先做NICS检测，对于异常结果再做活检以排除假阳性。因此，NICS技术具有很高的临床应用价值。
在临床试验中，研究者先招募了一个寻求辅助生殖的病人，该病人14和15号染色体的一部分发生交换，导致生殖细胞中染色体数目变异更容易发生。研究者通过人工受精得到3个胚胎，并用NICS对胚胎培养液中DNA进行检测。结果表明，其中1个胚胎染色体数目正常，另两个胚胎14或15号染色体数目都不对。正常的胚胎被植入母体，19周后通过传统羊水穿刺技术验证了胚胎染色体数目正常。今年3月5日，全球首个接受无创胚胎染色体筛查的试管婴儿健康诞生。
接下来，研究团队又招募了6例经历过反复流产、反复植入失败或染色体异常的病人。在NICS技术的帮助下，其中5例成功怀孕，4例已经生出健康的宝宝。“目前我们在无锡总共做了20多例病人，综合的成功率达到60%多，这个比例比不做检测显著提高。” 陆思嘉说。
“我们也是第一次提供了40多个胚胎的、严格比对的实验。”陆思嘉介绍，此前虽然有一些关于无创胚胎染色体筛查的零星报道，但并没有人严格地去做这个实验。这个系统性的实验“真正衡量了这个技术的有效性、准确性、特异性”。
关于该技术的应用前景，陆思嘉认为，经过完善后的NICS可以推广到大部分试管婴儿的病例。“我们正在组织一些多中心的临床试验，通过妊娠率、活产率等临床指标，和随访子代的安全性，进一步证实它的可靠性。NICS技术如果通过了进一步验证，我认为是完全可以取代现在的染色体筛查技术的。”
陆思嘉同时强调，虽然NICS未来进一步的研发和发展，有希望用于某些遗传病的筛查，但其当前的定位还是用于胚胎优选。由于培养液中DNA片段化严重，NICS技术无法覆盖整个染色体序列，所以对于非染色体数目相关的基因疾病来说，目前还是活检更为准确。
该研究由北京大学、无锡市妇幼保健院、南京军区总医院和亿康基因共同完成。
参考文献：
Juanjuan Xu, Rui Fang, Li Chen, Daozhen Chen, Jian-Ping Xiao, Weimin Yang, Honghua Wang, Xiaoqing Song, Ting Ma, Shiping Bo, Chong Shi, Jun Ren, Lei Huang, Li-Yi Cai, Bing Yao, X. Sunney Xie, and Sijia Lu(2016)，Noninvasive chromosome screening of human embryos by genome sequencing of embryo culture medium for in vitro fertilization,PNAS.
Battaglia, D. E., Goodwin, P., Klein, N. A., & Soules, M. R. (1996). Fertilization and early embryology: Influence of maternal age on meiotic spindle assembly oocytes from naturally cycling women. Human Reproduction, 11(10), 2217-2222.
Stigliani, S., Persico, L., Lagazio, C., Anserini, P., Venturini, P. L., & Scaruffi, P. (2014). Mitochondrial DNA in Day 3 embryo culture medium is a novel, non-invasive biomarker of blastocyst potential and implantation outcome. Molecular human reproduction, 20(12), 1238-1246.
Stigliani S, Anserini P, Venturini PL, Scaruffi P (2013) Mitochondrial DNA content in embryo culture medium is significantly associated with human embryo fragmenta- tion. Hum Reprod 28(10):2652–2660.
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